断裂内含肽及其用途制造技术

本发明专利技术一般地涉及鲁棒的断裂内含肽。本文中所描述的断裂内含肽在大的温度范围(包括低至0℃的温度)、在宽的pH范围中以及在离液盐存在下有活性。所述断裂内含肽还显示出对融合的异源性多肽中序列变异性的高度耐受性，并因此可用于蛋白质纯化和改造技术。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】断裂内含肽及其用途
本专利技术一般地涉及鲁棒的(robust)断裂内含肽(splitintein)及其用途，例如在蛋白质纯化和改造(engineering)中的用途。
技术介绍
内含肽(intein)是从其宿主蛋白质上自切除(self-excise)并催化侧翼序列(外显肽(extein))通过肽键连接的内部蛋白质元件。内含肽切除是不需要辅助酶或辅因子的翻译后加工。该自切割过程称为“蛋白质剪接”，类似于从前mRNA(pre-mRNA)上剪接RNA内含子(PerlerFetal.，NuclAcidsRes.22：1125-1127(1994))。内部蛋白质序列的区段称为“内含肽”，外部蛋白质序列的区段称为“外显肽”，其中上游外显肽称为“N-外显肽”并且下游外显肽称为“C-外显肽”。蛋白质剪接过程的产物是两个稳定的蛋白质：成熟蛋白质和内含肽。微小内含肽和大内含肽的结构内含肽分为两组：大(large)内含肽和极小(微小)(minimal(mini))内含肽(LiuXQ，AnnRevGenet34：61-76(2000))。大内含肽包含微小内含肽中所不存在的归巢内切核酸酶(homingendonuclease)结构域。高效剪接的微小内含肽已由大内含肽通过缺失中部内切核酸酶结构域而改造，表明该内切核酸酶结构域与蛋白质剪接无关(ChongS.andXuM.，JBiolChem.272：15587-15589(1997)；DerbyshireV.etal.，ProcNatlAcadSciUSA.94：11466-11471(1997)；以及ShingledeckerK.etal.Gene.207：187-195(1998))。所有已知的内含肽共有低程度的序列相似性，仅在N端和C端具有保守残基。大多数内含肽以Ser或Cys起始，并以His-Asn或以His-Gin结束。C-外显肽的首位氨基酸是不变的Ser、Thr或Cys，但N-外显肽的内含肽之前的残基并不保守(PerlerF.2002，Nucl.AcidsRes.30：383-384)。然而，最近发现N端外显肽和C端外显肽二者上邻近内含肽剪接点(intein-splicingjunction)的残基加速或减弱蛋白质剪接(AmitaiGetal.2009，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.106：11005-11010)。内含肽的顺式和反式剪接机制可以根据内含肽的剪接机制对其进行分类。第1类内含肽是研究最广泛的一组内含肽，其具有由四个保守剪接点残基中的三个介导的四个亲核攻击的快速过程。在步骤1中，剪接过程始于位于N端剪接结构域首位的丝氨酸或半胱氨酸残基的酰基转移(acyl-shift)。这在N-外显肽/内含肽接点形成(硫)酯键。在步骤2中，该(硫)酯键被C-外显肽中第一残基(Cys、Ser或Thr)的OH-或SH-基团攻击。这导致酯交换作用，将N-外显肽转移到C-外显肽第一残基的侧链上。在步骤3中，位于C端剪接结构域末位的保守Asn或Gin残基的环化使外显肽通过(硫)酯键连接。最后，步骤4是自发的S-N或O-N酰基转移引起的(硫)酯键向肽键的重排。图3A中示出直接或间接参与剪接反应的重要氨基酸。第1类内含肽中的内含肽-外显肽接点的位点特异性切割可以通过保守内含肽残基的突变来实现。内含肽C端Asn或Gin残基的突变破坏了剪接反应的步骤3和4，导致仅在N端切割。由于步骤1仍然发生，(硫)酯键可自发水解，使N-外显肽从内含肽/C-外显肽部分中分离。位于N端剪接结构域首位的丝氨酸或半胱氨酸残基是N端切割所需的(参见图3C)。内含肽的这一保守的首位残基的突变破坏了剪接反应的步骤1、2和4，导致仅在C端切割。在这样的突变内含肽中，Asn环化(步骤3)仍然发生，以使C-外显肽从N-外显肽/内含肽部分中分离。分别位于C端剪接结构域末位(XN)和倒数第二位(XN-1)的Asn(或Gin)和His残基是N端切割所需的(参见图3B)。改进的顺式剪接内含肽的可控切割已适用于分子生物学和生物技术中范围广泛的有用应用。天然断裂内含肽内含肽还可作为由两个分别转录和翻译之基因编码的两个片段而存在。这些所谓的断裂内含肽自组合(self-associate)并以反式催化蛋白质剪接活性。断裂内含肽已在多样的蓝细菌(cyanobacteria)和古细菌(archaea)中被鉴定出(Caspietal.，MolMicrobiol.50：1569-1577(2003)；ChoiJ.etal.，JMolBiol.356：1093-1106(2006.)；DassaB.etal.，Biochemistry.46：322-330(2007.)；LiuX.andYangJ.，JBiolChem.278：26315-26318(2003)；WuH.etal.，ProcNatlAcadSciUSA.95：9226-9231(1998.)；以及ZettlerJ.etal.，FEBSLetters.583：909-914(2009))，但在真核生物中至今仍未发现。最近，一项环境宏基因组数据(metagenomicdata)的生物信息学分析揭示了26个具有新基因组排列的不同基因座。在每个基因座处，保守的酶编码区被断裂内含肽中断，独立的内切核酸酶基因在编码内含肽亚结构域的区段之间插入。其中，五个基因座完整地装配：DNA解旋酶(gp41-1、gp41-8)；肌苷-5′-单磷酸脱氢酶(IMPDH-1)；以及核糖核苷酸还原酶催化亚基(NrdA-2和NrdJ-1)。该断裂基因组织(fracturedgeneorganization)看来主要存在于噬菌体中(Dassaetal.，NucleicAcidsResearch.37：2560-2573(2009))。断裂内含肽NpuDnaE的特征在于具有报导的蛋白质反式剪接反应的最高速率。另外，在温度介于6-37℃以及高至6M的尿素存在下，NpuDnaE蛋白剪接反应被认为对于不同外显肽序列来说都是鲁棒且高产的(ZettlerJ.etal.，FEBSLetters.583：909-914(2009)；IwaiI.etal.，FEBSLetters580：1853-1858(2006))。如所预料的，当在这些内含肽的N-结构域引入CyslAla突变时，最初的N至S的酰基转移和因此发生的蛋白质剪接被阻断。遗憾的是，C端切割反应也几乎被完全抑制。C端剪接点处的天冬酰胺环化对N端易断裂肽键处酰基转移的依赖似乎是天然断裂DnaE内含肽等位基因共有的独特特性(ZettlerJ.etal.FEBSLetters.583：909-914(2009))。内含肽在生物技术中的应用内含肽是范围广泛的生物技术应用中的有价值的工具。使用内含肽的天然剪接活性的肽和蛋白质连接被称为内含肽介导的蛋白质连接(intein-mediatedproteinligation，IPL)或表达蛋白连接(expressedproteinligation，EPL)，并且在分子生物学和生物技术方法中是公认的(EvansT.etal.，Biopolymers51：333-342(1999)；MuirT.etal.，ProcNa本文档来自技高网...

【技术保护点】
融合蛋白质，其包含(i)与选自SEQ ID NO：7、16、24、38和65的序列具有至少75％同一性的内含肽结构域，以及(ii)异源性多肽，其中所述异源性多肽位于内含肽结构域的C端。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.06.13 EP 12171848.0;2011.09.28 US 61/540,1011.融合蛋白质，其包含(i)选自SEQIDNO：7、16、24、38和65的内含肽结构域，以及(ii)异源性多肽，其中所述异源性多肽位于内含肽结构域的C端。2.权利要求1所述的融合蛋白质，其中所述异源性多肽与所述内含肽结构域通过肽键直接连接或通过接头连接。3.权利要求1所述的融合蛋白质，其中所述内含肽结构域的末位氨基酸被替换为谷氨酰胺。4.权利要求3所述的融合蛋白质，其中所述异源性多肽的首位氨基酸是丝氨酸、半胱氨酸或苏氨酸。5.权利要求2所述的融合蛋白质，其中所述内含肽结构域的末位氨基酸被替换为谷氨酰胺。6.权利要求5所述的融合蛋白质，其中所述异源性多肽或所述接头的首位氨基酸是丝氨酸、半胱氨酸或苏氨酸。7.权利要求1所述的融合蛋白质，其中所述内含肽结构域的末位氨基酸被替换为除了天冬酰胺或谷氨酰胺之外的氨基酸，并且其中所述异源性多肽的首位氨基酸是除了丝氨酸、半胱氨酸或苏氨酸之外的氨基酸。8.权利要求2所述的融合蛋白质，其中所述内含肽结构域的末位氨基酸被替换为除了天冬酰胺或谷氨酰胺之外的氨基酸，并且其中所述异源性多肽或所述接头的首位氨基酸是除了丝氨酸、半胱氨酸或苏氨酸之外的氨基酸。9.融合蛋白质，其包含(i)选自SEQIDNO：3、12、20、34和64的内含肽结构域，以及(ii)异源性多肽，其中所述异源性多肽位于所述内含肽结构域的N端。10.权利要求9所述的融合蛋白质，其中所述异源性多肽与所述内含肽结构域通过肽键直接连接或通过接头连接。11.权利要求9或10所述的融合蛋白质，其中所述内含肽结构域的首位氨基酸被替换为丝氨酸。12.权利要求9或10所述的融合蛋白质，其中所述内含肽结构域的首位氨基酸被替换为除了丝氨酸或半胱氨酸之外的氨基酸。13.包含第一内含肽结构域、第二内含肽结构域和异源性多肽的融合蛋白质，其中所述异源性多肽位于所述第一内含肽结构域的N端，并且其中所述异源性多肽位于所述第二内含肽结构域的C端，并且其中(a)所述第一内含肽结构域为SEQIDNO：3，并且所述第二内含肽结构域为SEQIDNO：7；(b)所述第一内含肽结构域为SEQIDNO：12，并且所述第二内含肽结构域为SEQIDNO：16；(c)所述第一内含肽结构域为SEQIDNO：20，并且所述第二内含肽结构域为SEQIDNO：24；或者(d)所述第一内含肽结构域为SEQIDNO：34，并且所述第二内含肽结构域为SEQIDNO：38；或者(e)所述第一内含肽结构域为SEQIDNO：64，并且所述第二内含肽结构域为SEQIDNO：65。14.权利要求13所述的融合蛋白质，其中所述异源性多肽和所述第二内含肽结构域通过肽键或通过接头连接，并且其中所述异源性多肽的首位氨基酸或所述接头的首位氨基酸是丝氨酸、半胱氨酸或苏氨酸。15.包含第一组分和第二组分的组合物或试剂盒，其中(i)所述第一组分是权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白质，以及(ii)所述第二组分选自N端内含肽结构域和权利要求12所述的融合蛋白质；其中a.来自权利要求1至6中任一项所述融合蛋白质的内含肽结构域为SEQIDNO：7，并且来自权利要求12所述融合蛋白质的内含肽结构域或所述N端内含肽结构域为SEQIDNO：3；b.来自权利要求1至6中任一项所述融合蛋白质的内含肽结构域为SEQIDNO：16，并且来自权利要求12所述融合蛋白质的内含肽结构域或所述N端内含肽结构域为SEQIDNO：12；c.来自权利要求1至6中任一项所述融合蛋白质的内含肽结构域为SEQIDNO：24，并且来自权利要求12所述融合蛋白质的内含肽结构域或所述N端内含肽结构域为SEQIDNO：20；d.来自权利要求1至6中任一项所述融合蛋白质的内含肽结构域为SEQIDNO：38，并且来自权利要求12所述融合蛋白质的内含肽结构域或所述N端内含肽结构域为SEQIDNO：34；或者e.来自权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白质的内含肽结构域为SEQIDNO：65，并且来自权利要求12所述融合蛋白质的内含肽结构域或所述N端内含肽结构域为SEQIDNO：64。16.包含第一组分和第二组分的组合物或试剂盒，其中(i)所述第一组分是权利要求9至11中任一项所述的融合蛋白质，并且(ii)所述第二组分选自C端内含肽结构域和权利要求7至8中任一项所述的融合蛋白质；其中a.来自权利要求9至11中任一项所述融合蛋白质的内含肽结构域为SEQIDNO：3，并且来自权利要求7或8所述融合蛋白质的内含肽结构域或所述C端内含肽结构域为SEQIDNO：7；b.来自权利要求9至11中任一项所述融合蛋白质的内含肽结构域为SEQIDNO：12，并且来自权利要求7或8所述融合蛋白质的内含肽结构域或所述C端内含肽结构域为SEQIDNO：16；c.来自权利要求9至11中任一项所述融合蛋白质的内含肽结构域为SEQIDNO：20，并且来自权利要求7或8所述融合蛋白质的内含肽结构域或所述C端内含肽结构域为SEQIDNO：24；d.来自权利要求9至11中任一项所述融合蛋白质的内含肽结构域为SEQIDNO：34，并且来自权利要求7或8所述融合蛋白质的内含肽结构域或所述C端内含肽结构域为SEQIDNO：38；或者e.来自权利要求9至11中任一项所述融合蛋白质的内含肽结构域为SEQIDNO：64，并且来自权利要求7或8所述融合蛋白质的内含肽结构域或所述C端内含肽结构域为SEQIDNO：65。17.包含权利要求1至6中任一项所述融合蛋白质和权利要求9至11中任一项所述融合蛋白质的组合物或试剂盒，其中a.来自权利要求1至6中任一项所述融合蛋白质的内含肽结构域为SEQIDNO：7，并且来自权利要求9至11中任一项所述融合蛋白质的内含肽结构域为SEQIDNO：3；b.来自权利要求1至6中任一项所述融合蛋白质的内含肽结构域为SEQIDNO：16，并且来自权利要求9至11中任一项所述融合蛋白质的内含肽结构域为SEQIDNO：12；c.来自权利要求1至6中任一项所述融合蛋白质的内含肽结构域为SEQIDNO：24，并且来自权利要求9至11中任一项所述融合蛋白质的内含肽结构域为SEQIDNO：20；d.来自权利要求1至6中任一项所述融合蛋白质的内含肽结构...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗塞·帕利斯贝格韦夫，斯特凡·罗伯特·施密特，迪达克·马尔科费利乌，帕特里西亚·卡林娜·卡瓦哈尔巴列霍斯，
申请(专利权)人：时代生物技术股份公司，
类型：发明
国别省市：西班牙;ES