稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的脊椎动物细胞系及其制备方法技术

本发明专利技术属生物技术领域，涉及一种稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的脊椎动物细胞系及其制备方法；本发明专利技术涉及的哺乳动物细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1/CAF13CCTCC C2015182。本发明专利技术还涉及所述细胞系的制备方法，包括如下步骤：培养CHO-K1细胞；取pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒，转染CHO-K1细胞，获得转染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒的转染细胞；取转染细胞，传代培养，通过抗生素筛选获得细胞克隆；挑取细胞克隆，扩大培养并鉴定，获得强阳性表达细胞克隆，筛选，即得所述细胞系。本发明专利技术涉及的哺乳动物细胞系能够稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶，实现了在哺乳动物细胞中获得并生产具有核心α(1,3)岩藻糖基化的N型糖蛋白。

【技术实现步骤摘要】
稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的脊椎动物细胞系及其制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的脊椎动物细胞系及其制备方法。
技术介绍
现行研究显示，包括哺乳动物在内的脊椎动物没有核心α(1,3)岩藻糖基转移酶活性。因此，具有核心α(1,3)岩藻糖化的脊椎动物和哺乳动物蛋白可具有新的理化特性和生物学特性，具有广阔的应用前景。例如，对复杂生物过程的理解依赖于对特定分子在包括蛋白质分子间动态相互作用在内的的定位和示踪。虽然通过对越来越多种生物的DNA测序鉴别了蛋白的开放阅读框(ORF)，但是在体内和体外对相应蛋白质性质的鉴定的方法仍是有限的。现有技术中，绝大多数致力于实现这一目标的策略基于构建一个融合蛋白，这个融合蛋白带有的融合多肽标记不仅可以用作蛋白纯化以在体外应用，也可以进一步在体内应用。研究实践中应用的标签实例包括FLAG标签、6XHis标签、S－谷胱甘肽转移酶、麦芽糖结合蛋白、绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白和抗原决定簇标签等，但是这些标记都或多或少的改变了原有蛋白的氨基酸序列，而基于N型糖蛋白上的核心α(1,3)岩藻糖化标记则无需改变现有N型糖蛋白的氨基酸序列，且在后续对标记过的N型糖蛋白的体内外检测，示踪和/或操纵也无需制备特异的抗体，使用通用的抗核心α(1,3)岩藻糖的抗体便可以实现，使用方便。经对现有技术的文献检索，专利文献201010607689.6(公开日2011年9月7日)披露了一种检测IgG岩藻糖化的方法及其应用。该方法利用凝集素检测位于IgG上的核心α(1,6)岩藻糖化度和位于糖链末端的α(1,3)岩藻糖化度，用于乙肝患者中慢性肝炎患者和肝硬化患者的鉴别诊断。该文献披露的技术方案不涉及蛋白核心α(1,3)岩藻糖化，不涉及核心α(1,3)岩藻糖基转移酶，也不涉及核心α(1,3)岩藻糖基转移酶在哺乳动物细胞内的表达。如前所述，天然脊椎和哺乳动物细胞虽然具有蛋白核心α(1,6)岩藻糖化以及末端α(1,3)岩藻糖化的能力，但没有核心α(1,3)岩藻糖基转移酶活性。迄今尚未见有稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的哺乳动物细胞系报道。虽然部分植物和昆虫具有核心α(1,3)岩藻糖基转移酶，由于以下众多的不确定因素：限制了核心α(1,3)岩藻糖基转移酶在哺乳动物中的表达和应用：1.不同种属的细胞糖链具有种属特性，糖链的特异性可限制核心α(1,3)岩藻糖基转移酶活性；2。蛋白序列也有种属特性蛋白序列的特异性可限制核心α(1,3)岩藻糖基转移酶活性；3。不同种属的细胞有结构特异性，细胞的基本结构可限制核心α(1,3)岩藻糖基转移酶活性；4。细胞内环境pH和盐浓度，可能限制核心α(1,3)岩藻糖基转移酶活性；5。不同的细胞可能使用完全不同的底物系统；6。酶的细胞内分布可能限制核心α(1,3)岩藻糖基转移酶活性。基于现有技术的现状，本申请的专利技术人拟建立一种稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的哺乳动物细胞系及其制备方法。与融合蛋白标记技术相比，由核心α(1,3)岩藻糖基化标记的蛋白，不带有可引起宿主免疫反应的融合多肽，蛋白序列不发生变化；与在昆虫和植物细胞中表达的蛋白相比，并可排除由昆虫或植物细胞糖链以及蛋白酶带来的异质性。进一步的本专利技术的上述方法可用于其它的脊椎动物细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，利用蛋白糖修饰的种属差异，提供一种稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的哺乳动物细胞系及其制备方法。本专利技术涉及的细胞系能够稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶，并进一步实现在哺乳动物细胞中产生核心α(1,3)岩藻糖基化的N型糖蛋白，核心α(1,3)岩藻糖基化标记为通用标记，可用于不同蛋白在复杂生物系统理解和蛋白质分子间潜在的相互作用的示踪和体内体外的研究，具有广阔的基础和应用价值。本专利技术是通过以下的技术方案实现的，第一方面，本专利技术提供一种稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的哺乳动物细胞系。优选地，所述细胞系可通过包括如下步骤的方法制备：取源于非哺乳动物的核心α(1,3)岩藻糖基转移酶基因，导入哺乳动物细胞系即得；所述细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1，或中国仓鼠卵巢细胞CHO-S，或人胚肾细胞系HEK293。第二方面，本专利技术提供一种稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的细胞系，所述细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1/CAF13CCTCCC2015182。第三方面，本专利技术涉及一种前述中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1/CAF13CCTCCC2015182的制备方法，包括如下步骤：步骤一、培养CHO-K1细胞；步骤二，取pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒，转染CHO-K1细胞，获得转染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒的转染细胞；步骤三，取步骤二得到的转染细胞，传代培养，通过抗生素筛选获得细胞克隆；步骤四，挑取细胞克隆，扩大培养并鉴定，获得强阳性表达细胞克隆，筛选，即得所述细胞系，即中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1/CAF13CCTCCC2015182。优选地，所述步骤一包括如下步骤：取100mm细胞培养皿，加入10mL新鲜F12K完全培养基，所述F12K完全培养基含10％胎牛血清及青链霉素，在培养皿中加入CHO-K1细胞，孵育。优选地，所述在培养皿中加入CHO-K1细胞具体为：按每个培养皿1.25x106个CHO-K1细胞浓度加入细胞，之后放入CO2培养箱中37℃孵育过夜。优选地，所述步骤二包括如下步骤：取pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒，浓度为453ng/μL；按照每2mLOpti-Mem中含有24μg质粒和40μLLipofectamine2000转染试剂配制转染复合物，摇匀后室温放置5分钟；取铺有CHO-K1细胞的100mm细胞培养皿加入2mL上述配制的转染复合物，摇匀后放入37℃CO2培养箱中继续孵育6小时；6小时后将培养皿取出，吸掉全部培养基，缓慢加入新鲜的F12K完全培养基，然后放入37℃CO2培养箱中培养24小时，获得转染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒的CHO-K1细胞。优选地，所述步骤三包括如下步骤：取转染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒24小时后的CHO-K1细胞，使用预先加入G418的F12K完全培养基，37℃CO2培养箱中进行传代培养。优选地，所述步骤三包括如下步骤：将转染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒24小时后的CHO-K1细胞取出，吸掉全部培养液上清，用10mLPBS洗一遍，加入2mL胰酶消化液；室温放置并消化5-7分钟作用，吸掉胰酶消化液，再放置2-4分钟；等待期间取3个新100mm细胞培养皿，每个预先加入10mL含有800μg/mLG418的F12K完全培养基，待用；倒置显微镜下观察，待所有细胞脱壁后立刻加入10mL新鲜F12K完全培养基，缓慢吹打几遍；将细胞悬液取1/30的体积分别加入到刚才准备的3个100mm细胞培养皿中，轻轻摇匀后放入37℃CO2培养箱中培养数天后；再次按照上述方法传代细胞一次，继续培养若干天，待细胞群落生长出来后，挑取细胞克隆待用。优选地，步骤四中，所述筛选包括如下步骤：通过极本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的脊椎动物细胞系，所述细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO‑K1/CAF13 CCTCC C2015182。

【技术特征摘要】
1.一种稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的脊椎动物细胞系，所述细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1/CAF13CCTCCC2015182。2.根据权利要求1所述的细胞系，其特征在于，所述细胞系通过包括如下步骤的方法制备：取源于非哺乳动物的核心α(1,3)岩藻糖基转移酶基因，导入脊椎动物细胞系即得；所述细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1，或中国仓鼠卵巢细胞CHO-S，或人胚肾细胞系HEK293。3.一种如权利要求1所述的细胞系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、培养CHO-K1细胞；步骤二，取pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒，转染CHO-K1细胞，获得转染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒的转染细胞；步骤三，取步骤二得到的转染细胞，传代培养，通过抗生素筛选获得细胞克隆；步骤四，挑取细胞克隆，扩大培养并鉴定，获得强阳性表达细胞克隆，筛选，即得所述细胞系，即中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1/CAF13CCTCCC2015182。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征是，所述步骤一包括：取100mm细胞培养皿，加入10mL新鲜F12K完全培养基，所述F12K完全培养基含10％胎牛血清及青链霉素，在培养皿中加入CHO-K1细胞，孵育。5.如权利要求3所述的制备方法，其特征是，所述在培养皿中加入CHO-K1细胞为：按每个培养皿1.25x106个CHO-K1细胞浓度加入细胞，之后放入CO2培养箱中37℃孵育过夜。6.如权利要求3所述的制备方法，其特征是，所述步骤二包括：取pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒，浓度为453ng/μL；按照每2mLOpti-Mem中含有24μg质粒和40μLLipofectamine2000转染试剂配制转染复合物，摇匀后室温放置5分钟；取铺有CHO-K1细胞的100mm细胞培养皿加入2mL上述配制的转染复合物，摇匀后放入37℃CO2培养箱中继续孵育6小时；6小时后将培养皿取...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈力，余欣，王蕾，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31