【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及car-t细胞检测分析，具体涉及一种适用于流式细胞术监测car-t细胞数量及功能的检测试剂及方法。
技术介绍
1、嵌合抗原受体t细胞疗法属于人体细胞免疫疗法的一种，现在已经成为多发性、复发性、难治性肿瘤的有效治疗方案。其是从患者血液中提取t细胞，并在体外通过基因改造装上识别癌细胞表明抗原的“嵌合抗原受体(car)”，细胞经过体外持续扩增，再输注回患者体内。在该方法中，修饰后的细胞回输体内后能够取得决定疗效取决于car-t细胞的质量、数量以及回输体内后car-t细胞的质量及绝对个数。
2、目前，还没有一种能够检测体内外car-t细胞的质量和数量的方法，使得治疗疗效无法及时的进行有效把控，不便于治疗方案的制定。
技术实现思路
1、针对现有技术所存在的技术问题，本专利技术提供了一种适用于流式细胞术监测car-t细胞数量及功能的检测试剂，其能够及时有效的对car-t细胞的质量和数量进行监测，为新的治疗方案的确定和调整提供技术指导。
2、本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供一种适用于流式细胞术监测car-t细胞数量及功能的检测试剂，包括第一组抗体混合物、第二组抗体混合物和第三组抗体，第一组抗体混合物包括cd3抗体、bcma-car抗体、ctla4抗体、klrg1抗体、cd8抗体、cd4抗体和cd45抗体；第二组抗体混合物包括bcma-car抗体、cd3抗体、cd28抗体、cd45ra抗体、cd8抗体、cd62l抗体、cd45抗体、pd-1抗体；第三
3、具体地，所述抗体为荧光标记的单克隆抗体；其中，第一组抗体混合物包括cd3fitc、bcma-car pe、ctla4 apc、klrg1 pe-cy7、cd8 apc-cy7、cd4 v450、cd45 v500荧光标记抗体；第二组抗体混合物包括bcma-carpe、cd3 percp、cd28 apc、cd45ra pe-cy7、cd8apc-cy7、cd62l bv510、cd45 pacific bule、pd-1bv605荧光标记抗体；第三组抗体为ccd107a fitc荧光标记抗体。
4、作为一种优选的实施方式，在第一组抗体混合物中，cd3抗体、bcma-car抗体、ctla4抗体、klrg1抗体、cd8抗体、cd4抗体和cd45抗体按照10:2:3:10:3:3:3的体积比混合；在第二组抗体混合物中，bcma-car抗体、cd3抗体、cd28抗体、cd45ra抗体、cd8抗体、cd62l抗体、cd45抗体、pd-1抗体按照2:3:10:10:3:3:8:3的体积比混合。
5、本专利技术的目的还在于提供一种适用于流式细胞术监测car-t细胞数量及功能的检测试剂盒，包括试剂a、试剂b和试剂c，所述试剂a为上述的第一组抗体混合物，所述试剂b为上述的第二组抗体混合物，所述试剂c为上述的第三组抗体。
6、本专利技术的目的之三还在于提供一种流式细胞术监测car-t细胞数量及功能的系统，包括检测部分和分析部分；
7、所述检测部分包括权利要求1～3任一项所述的检测试剂，用于通过流式细胞术检测car-t治疗后的患者外周血中的抗原表达水平；
8、所述分析部分用于分析检测部分的检测结果。
9、其中，所述分析部分分析指标为：car+cd8+/有核细胞、car+cd3+cd8+/car+cd3+、cd45ra-cd62l+/car+cd8+、cd45ra+cd62l+/car+cd8+、cd45ra-cd62l-/car+cd8+、cd45ra+cd62l-/car+cd8+、cd107a+/car+cd8+、cd28+/car+cd8+、ctla4+/car+cd8+、pd-1+/car+cd8+、klrg1+/car+cd8+、car+cd3+/有核细胞、car+cd3+cd4+/car+cd3+、cd45ra-cd62l+/car+cd3+、cd45ra+cd62l+/car+cd3+、cd45ra-cd62l-/car+cd3+、cd45ra+cd62l-/car+cd3+、cd107a+/car+cd3+、cd28+/car+cd3+、ctla4+/car+cd3+、pd-1+/car+cd3+、klrg1+/car+cd3+；
10、其中，car+cd8+/有核细胞(绝对个数)、car+cd3+/有核细胞(绝对个数)、car+cd3+cd8+/car+cd3+、car+cd3+cd4+/car+cd3+为评估car-t细胞数量的指标；
11、cd45ra-cd62l+/car+cd8+、cd45ra+cd62l+/car+cd8+、cd45ra-cd62l-/car+cd8+、cd45ra+cd62l-/car+cd8+、cd45ra-cd62l+/car+cd3+、cd45ra+cd62l+/car+cd3+、cd45ra-cd62l-/car+cd3+、cd45ra+cd62l-/car+cd3+为评估car-t细胞活化的指标；
12、cd107a+/car+cd8+、cd28+/car+cd8+、ctla4+/car+cd8+、pd-1+/car+cd8+、klrg1+/car+cd8+cd107a+/car+cd3+、cd28+/car+cd3+、ctla4+/car+cd3+、pd-1+/car+cd3+、klrg1+/car+cd3+为评估car-t细胞效应及免疫监测点的指标。
13、作为一种优选的实施方式，所述检测部分的检测方法如下：
14、(1)分别向含有第一组抗体混合物的panel 1绝对计数管和含有第二组抗体混合物的panel 2普通流式管中加入经car-t治疗后的患者外周血，避光孵育后分别加入裂解液，混匀，继续室温避光孵育；
15、(2)将含有第一组抗体混合物的panel 1绝对计数管置于流式细胞仪中进行上机检测；将含有第二组抗体混合物的panel 2普通流式管低速离心，去上清，之后加入pbs缓冲液，混匀后继续低速离心，去上清，向沉淀中加入破膜剂，轻柔混匀病并温避光处理，再次离心并用pbs洗涤，之后向沉淀中加入第三组抗体，第三组抗体中ccd 107a抗体的用量与第二组抗体混合物的体积比例为10:42(保证第三组抗体ccd 107a抗体的用量与第二组抗体混合物中bcma-car抗体、cd3抗体、cd28抗体、cd45ra抗体、cd8抗体、cd62l抗体、cd45抗体、pd-1抗体的体积比例为10:2:3:10:10:3:3:8:3)，轻柔混匀后室温避光处理，低速离心去上清，用pbs重悬后再上机检测。
16、本专利技术的目的还在于保护上述检测试剂在多发性骨髓瘤患者car-t细胞疗法中的应用。
17、本专利技术所提供的适用于流式细胞术监测car-t细胞数量及功能的检测试剂及方法，其能本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.适用于流式细胞术监测CAR-T细胞数量及功能的检测试剂，包括第一组抗体混合物、第二组抗体混合物和第三组抗体，其特征在于，
2.根据权利要求1所述的适用于流式细胞术监测CAR-T细胞数量及功能的检测试剂，其特征在于，所述抗体为荧光标记的单克隆抗体；
3.根据权利要求1所述的适用于流式细胞术监测CAR-T细胞数量及功能的检测试剂，其特征在于，
4.一种适用于流式细胞术监测CAR-T细胞数量及功能的检测试剂盒，其特征在于，包括试剂A、试剂B和试剂C，所述试剂A为权利要求1中所述的第一组抗体混合物，所述试剂B为权利要求1中所述的第二组抗体混合物，所述试剂C为权利要求1中所述的第三组抗体。
5.一种流式细胞术监测CAR-T细胞数量及功能的系统，其特征在于，包括检测部分和分析部分；
6.根据权利要求5所述的流式细胞术监测CAR-T细胞数量及功能的系统，其特征在于，所述分析部分分析指标为：CAR+CD8+/有核细胞、CAR+CD3+CD8+/CAR+CD3+、CD45RA-CD62L+/CAR+CD8+、CD45RA+CD62L+
7.根据权利要求5所述的流式细胞术监测CAR-T细胞数量及功能的系统，其特征在于，所述检测部分的检测方法如下：
8.权利要求1～3任一项所述的检测试剂在多发性骨髓瘤患者CAR-T细胞疗法中的应用。
...【技术特征摘要】
1.适用于流式细胞术监测car-t细胞数量及功能的检测试剂，包括第一组抗体混合物、第二组抗体混合物和第三组抗体，其特征在于，
2.根据权利要求1所述的适用于流式细胞术监测car-t细胞数量及功能的检测试剂，其特征在于，所述抗体为荧光标记的单克隆抗体；
3.根据权利要求1所述的适用于流式细胞术监测car-t细胞数量及功能的检测试剂，其特征在于，
4.一种适用于流式细胞术监测car-t细胞数量及功能的检测试剂盒，其特征在于，包括试剂a、试剂b和试剂c，所述试剂a为权利要求1中所述的第一组抗体混合物，所述试剂b为权利要求1中所述的第二组抗体混合物，所述试剂c为权利要求1中所述的第三组抗体。
5.一种流式细胞术监测car-t细胞数量及功能的系统，其特征在于，包括检测部分和分析部分；
6.根据权利要求5所述的流式细胞术监测car-t细胞数量及功能的系统，其特征在于，所述分析部分分析指标为：car+cd8+/有核细胞、car+cd3+cd8+/car+cd3+、cd45ra-cd62l+/...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑金娥，梅恒，杜雯，李娟，刘伟，李成功，马耀坤，章钰，黄士昂，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：
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