PTH模拟肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种新的PTH模拟肽，该PTH模拟肽能够特异性地激活PLC非依赖、PKA非依赖的PKC信号通路，还能够有效促进成骨细胞分化，促进骨折愈合，部分效果优于PTH(1‑34)。该PTH模拟肽具有很好的科研应用以及治疗骨质疏松症的临床药用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体是涉及一种PTH模拟肽及其应用。
技术介绍
骨质疏松症可以被定义为全身性骨骼疾病，具有低骨量、骨组织微观结构退化以及增加的骨脆性和易于骨折的特征。骨质疏松症是严重影响老年人群身体健康和生命存在的常见疾病。目前，治疗骨质疏松的常见药物包括抗骨吸收药物和促骨合成药物，前者不能有效提高骨质量，需要长期用药，后者能较快提高骨质量，预防骨折的发生，尤其对重度骨质疏松效果明显。甲状旁腺素(PTH)是由甲状旁腺分泌的一种多肽激素，是生物体内调节钙、磷代谢平衡的一种重要因子。它含有84个氨基酸，此外尚存在着一些短链降解产物，这些产物都具有一定的活性，鉴于生物的复杂性，还未受到的广泛研究和应用。特立帕肽(PTH(1-34))是目前唯一的促骨合成药物，在临床应用证明了其独特的有效性。PTH(1-34)通过直接激活cAMP/PKA,PLC/PKC等信号转导途径发挥其作用。有研究证明PLC非依赖性PKC可能促进骨合成，但缺乏强有力的证据。由于PTH(1-34)能够激活多个信号通路，兼具促骨合成和促骨吸收的作用，其净效果在小剂量间断使用时表现为骨合成，大剂量持续使用时净效果为促进骨吸收。PTH(1-34)的效果远未达到临床需要的效果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的PTH模拟肽，其具有很好的应用于科研研究和临床应用。其技术方案如下：氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的PTH模拟肽。氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的，前段1-18位中有1-5个的氨基酸突变但活性不变的PTH模拟肽。优选地，所述PTH模拟肽的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的另一目的是提供上述PTH模拟肽的应用。其技术方案如下：上述PTH模拟肽在制备防治骨质疏松症的药物中的应用。本专利技术的另一目的是提供一种防治骨质疏松症的药物。其技术方案如下：一种防治骨质疏松症的药物，其活性成份含有上述PTH模拟肽。本专利技术根据临床经验，经过大量的实验，通过对现有的针对PTH(1-34)的一重要功能基团PTH(29-34)进行重复，并裁剪PTH(1-34)的N端两个氨基酸，设计了新的具有单一信号转导功能的模拟肽MY-1。所述的MY-1肽PTH(3-34)(29-34)的分子序列:即SEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNYQDVHNY其中，我们独有的创新是将第34位氨基酸F突变为Y后再将QDVHNY系列重复一次，使之具有独特的分子信号刺激特征，并具有优越的促进骨合成的效果。我们在上述的基础上进行了进一步的突变，即MMY-1肽序列为：AibEIQLMHQHarAKWLNSMRRVEWLRKKLQDVHNYQDVHNY。发现它具有非常好的促骨合成效果。本专利技术的有益效果在于：1.本专利技术独特设计的PTH模拟肽能够特异性地激活PLC非依赖、PKA非依赖的PKC信号通路。可见，该PTH模拟肽可为科研研究提供了有用的工具。2.细胞和动物实验证明，本专利技术所述的MY-1肽能够有效促进成骨细胞分化，促进骨折愈合，部分效果优于PTH(1-34)。可见，该PTH模拟肽具有很好的治疗骨质疏松症的临床药用价值。附图说明图1是实施例1中PTH模拟肽的信号转导特征的示意图；图2是实施例3中PTH模拟肽的促进成骨细胞表达成骨基因碱性磷酸酶的示意图；图3是实施例4中PTH模拟肽促进去势雄性小数胫骨松质骨形成的作用的示意图；图4是实施例5中PTH模拟肽促进去势雄性小数骨折愈合的作用示意图。具体实施方式下面对本专利技术的实施例进行详细说明。本实施例提供了一种氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的PTH模拟肽(MY-1肽)，在该MY-1肽的基础上，其前端(从N端开始)1-17位上，可以发生1-5个氨基酸的突变，但MY-1肽所具有的活性(特异性地激活PLC非依赖、PKA非依赖的PKC信号通路，抑制成骨细胞凋亡，促进成骨细胞分化，促进骨折愈合)，突变后的相应的PTH模拟肽的不会改变，例如，MY-1肽的第17位的E可以突变为R。这些位点的突变主要是增加肽与其受体的结合力从而促进生物学效果，本领域的技术人员，可以根据现有的技术报道对MY-1肽作出相应的改变。此外，SEQIDNO.1中的(29-F34Y)部分中的Y，也可以为与天然的PTH(1-34)第34位一样，氨基酸为F，如SEQIDNO.7。本实施例所述的PTH模拟肽可用于制备防治骨质疏松症的药物。本实施例还涉及一种防治骨质疏松症的药物，其活性成份含有上述PTH模拟肽。以下具体实施例所涉及到的各种PTH肽，其具有以下氨基酸组成。实施例1将PTH受体(PTHR1)基因转染HEK293细胞株(不表达PTHR1)，挑选稳定表达PTHR1的细胞克隆(PTHR1受体基因已经插入HEK293细胞的基因组，受体基因的表达稳定；以下称为HEK293-PTHR1细胞)。实验结果参见图1。从图1A可以看出，(10-5M)PTH(3-34),MY-1肽(10-5M，10-6M)刺激4小时不能激活HEK293-PTHR1细胞内PLC信号从而增加IP的生成量，但是PTH(1-34)具有激活PLC的功能。图1B显示PTH(3-34)(10-5M),MY-1肽(10-5M，10-6M)4小时刺激不能促进HEK293-PTHR1细胞内的cAMP生成量。为了检测细胞内PKC激活情况，我们将PKC激活荧光检测分子CKAR转染HEK193-PTHR1细胞(HEK193-PTHR1-CKAR细胞)(注：如果PKC激活，将引起其作用底物磷酸化，CKAR分子产生构型改变，导致CKAR分子两端的CFP，YFP荧光能量的转移发生改变，显示为C/Y比值的改变。通过检测荧光能量转移变化，显示PKC的激活情况)。用10-5M的MY-1肽刺激HEK193-PTHR1-CKAR细胞100ms后，出现荧光能量转移改变，显示PKC激活，而PKC抑制剂Go6983的加入使MY-1肽的作用发生反转，证实了MY-1肽具有激活PKC的作用。(我们另外的研究已经证明PTH(1-34)也具有类似作用。如果将CKAR分子转染进不含PTHR1受体的细胞(HEK293-CKAR细胞)，MY-1肽不能激活PKC，但激活剂TPA(无需进过特殊受体的PKC激活剂)可以激活PKC信号。以上实验结果说明，与PTH(1-34)比，MY-1肽具有PLC非依赖(nonPLC)，PKA非依赖(nonPKA)的PKC激活的独特的信号转导特征(表1)。据我们所知，目前所有的PTH模拟肽均不具有如此单纯的信号转导特性，我们创造性的重复某一特征性蛋白功能基团达到了意想不到的效果。表1MY-1肽具有的信号转导特点cAMP/PKAPLC/PKCnonPLC/PKCPTH(1-34)YesYesYesMY-1肽NoNoYes实施例2：MY-1肽和MMY-1的抑制成骨细胞凋亡将成骨细胞株MC3T3-E1以4x105/孔的密度接种如24孔板，等孔内细胞密度达80％(导致显微镜观察和测量)时，将10％血清+α-MEM培养基换成1％血清+α-MEM培养基继续培养24小时，10-6M的MY-1肽，10-6M的MMY-1肽和10-8MPTH(1-34)分别加入1％血清+α-MEM培养基继续培养4小时后，0.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的PTH模拟肽。

【技术特征摘要】
1.氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的PTH模拟肽。2.氨基酸序列如SEQIDNO.7所示的PTH模拟肽。3.氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的，前段1-18位中有1-5个的氨基酸突变但活性不变的PTH模拟肽。4.根据权利要求3所述的PTH模拟肽，其特征在于，所述PTH模拟肽的氨基酸序列如S...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨德鸿，闫文娟，
申请(专利权)人：杨德鸿，
类型：发明
国别省市：广东;44