用于淀粉加工的酶制造技术

本发明专利技术涉及用于淀粉加工的酶，具体地本发明专利技术涉及包含碳水化合物结合模块氨基酸序列和α‑淀粉酶氨基酸序列的多肽，以及这些多肽的应用。

An enzyme used in starch processing

The present invention relates to enzymes for starch processing, specifically the invention relates to a carbohydrate binding module of peptide amino acid sequence and alpha amylase amino acid sequence, and the application of these polypeptides.

【技术实现步骤摘要】
用于淀粉加工的酶本专利技术申请是基于申请日为2005年12月22日、申请号200580048598.0(国际申请号为PCT/US2005/046725)、名称为“用于淀粉加工的酶”的专利技术专利申请的分案申请。与序列表和保藏微生物的交叉参考本申请包含序列表形式的信息，其附加于本申请，同时伴随本申请也提交了其数据载体。此外，本申请涉及保藏的微生物。本文将数据载体的内容和保藏的微生物完全加入作为参考。专利技术所属领域本专利技术涉及包含碳水化合物结合模块(“CBM”)和α-淀粉酶催化结构域的多肽。另外，本专利技术涉及包含有用的α-淀粉酶催化结构域和/或CBM的野生型α-淀粉酶多肽，还涉及催化结构域序列和/或CBM序列。本专利技术还涉及这些多肽在将淀粉降解为较小的寡糖和/或多糖片段的淀粉液化过程中的用途。专利技术背景已经描述了许多将淀粉转化为淀粉水解产物，如麦芽糖、葡萄糖或特种糖浆的酶和方法，所述淀粉水解产物或者用作甜味剂或者用作其它糖类例如果糖的前体。也可以将葡萄糖发酵为乙醇或其它发酵产物，如柠檬酸、谷氨酸单钠、葡糖酸、葡糖酸钠、葡糖酸钙、葡糖酸钾、葡糖酸Δ内酯(gluconodeltalactone)、或者异抗坏血酸钠、衣康酸、乳酸、葡糖酸；酮；氨基酸、谷氨酸(谷氨酸单钠(sodiummonoglutaminate))、青霉素、四环素；酶；维生素，如核黄素、B12、β－胡萝卜素或激素。淀粉是由葡萄糖单元的链组成的高分子量多聚物。其通常由约80％支链淀粉和20％直链淀粉构成。支链淀粉是支链多糖，其中α-1,4D-葡萄糖残基的线性链通过α-1,6糖苷键相连。直链淀粉是线性多糖，由通过α-1,4糖苷键连接在一起的D-吡喃型葡萄糖单位组成。在将淀粉转化为可溶性淀粉水解产物的情况下，所述淀粉被解聚。常规解聚方法由糊化步骤和两个连续的处理步骤，即液化处理和糖化处理组成。颗粒状淀粉由细微的颗粒组成，其在室温下不溶于水。当加热水性淀粉浆时，所述颗粒膨胀并最终破裂，将淀粉分子分散到溶液中。在该“糊化”过程中，粘性急剧增加。由于典型工业方法中固体水平为30-40％，因而必须稀释或者“液化”淀粉以使之能够被处理。现在，此粘性的减小大多通过酶促降解而获得。液化步骤期间，长链淀粉被α-淀粉酶降解为较小的分枝和线性单元(麦芽糖糊精)。典型地，液化过程在约105-110℃实施约5至10分钟，之后在约95℃实施大约1-2小时。然后将温度降低到60℃，添加葡糖淀粉酶(也称为GA或AMG)或β－淀粉酶以及任选脱支酶，如异淀粉酶或支链淀粉酶，并且进行糖化过程约24至72小时。由上述讨论可明显看出传统的淀粉转化过程是非常耗能的，因为不同步骤期间在温度方面有不同的需求。因此希望能够选择和/或设计用于所述过程的酶，以便能够实施整个过程而无需将淀粉糊化。美国专利4,591,560、4,727,026、和4,009,074、EP专利0171218以及丹麦专利申请PA200300949有这样的“生淀粉”处理过程。本专利技术披露了特别为这样的过程设计的多肽，其包含CBM的氨基酸序列和淀粉降解酶的氨基酸序列。杂合酶是WO9814601、WO0077165、和PCT/US2004/020499的主题。专利技术概述专利技术人已令人惊讶地发现通过向特定α-淀粉酶添加碳水化合物结合模块(CBM)能够改变活性和特异性，从而增强不同淀粉降解过程的功效，例如，包括生的，例如非糊化淀粉和/或糊化淀粉的降解。也可以通过用另一种CBM替代一种CBM而改变活性和特异性。这些由具有α-淀粉酶活性和主要具有针对淀粉的亲合力的碳水化合物结合模块的多肽组成的杂合体较现有的α-淀粉酶有优势，这通过选择具有所需特性的催化结构域来实现，所需特性例如pH谱、温度谱、抗氧化性、钙稳定性、底物亲合力或产物谱，该催化结构域能够与碳水化合物结合模块联合，所述碳水化合物结合模块具有更强或更弱结合亲合力，所述亲合力例如针对直链淀粉的特异性亲合力、针对支链淀粉的特异性亲合力或者针对碳水化合物中的特定结构的亲合力。因此本专利技术涉及相对于不含CBM的α-淀粉酶和/或相对于现有技术的淀粉酶具有改变特性的杂合体，如在低pH，例如，在低于4的pH，如在3.5时具有增强的稳定性和/或活性，在低pH甚至在缺乏葡糖淀粉酶的情况下或者在低葡糖淀粉酶水平时具有针对颗粒状淀粉的增强活性和/或颗粒状淀粉降解增强，和/或具有改变的产物谱。由于这些多肽的优越的水解活性，整个淀粉转化处理能够无需糊化淀粉而进行，即所述多肽水解生淀粉处理中的颗粒状淀粉以及传统淀粉处理中的完全或部分糊化的淀粉。因此第一个方面本专利技术提供包含含有催化模块的第一个氨基酸序列和含有碳水化合物结合模块的第二个氨基酸序列的多肽，所述催化模块具有α-淀粉酶活性，其中所述第二个氨基酸序列与选自下组的任一氨基酸序列具有至少60％的同源性：SEQIDNO:52、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90、SEQIDNO:92、SEQIDNO:94、SEQIDNO:96、SEQIDNO:98、SEQIDNO:109、SEQIDNO:137、SEQIDNO:139、SEQIDNO:141和SEQIDNO:143。第二个方面本专利技术提供具有α-淀粉酶活性的多肽，其选自下组：(a)具有与选自下组的成熟多肽的氨基酸有至少75％同源性的氨基酸序列的多肽：SEQIDNO:14中的氨基酸1-441、SEQIDNO:18中的氨基酸1-471、SEQIDNO:20中的氨基酸1-450、SEQIDNO:22中的氨基酸1-445、SEQIDNO:26中的氨基酸1-498、SEQIDNO:28中的氨基酸18-513、SEQIDNO:30中的氨基酸1-507、SEQIDNO:32中的氨基酸1-481、SEQIDNO:34中的氨基酸1-495、SEQIDNO:38中的氨基酸1-477、SEQIDNO:42中的氨基酸1-449、SEQIDNO:115中的氨基酸1-442、SEQIDNO:117中的氨基酸1-441、SEQIDNO:125中的氨基酸1-477、SEQIDNO:131中的氨基酸1-446、SEQIDNO:157中的氨基酸41-481、SEQIDNO:159中的氨基酸22-626、SEQIDNO:161中的氨基酸24-630、SEQIDNO:163中的氨基酸27-602、SEQIDNO:165中的氨基酸21-643、SEQIDNO:167中的氨基酸29-566、SEQIDNO:169中的氨基酸22-613、SEQIDNO:171中的氨基酸21-463、SEQIDNO:173中的氨基酸21-587、SEQIDNO:175中的氨基酸30-773、SEQIDNO:177中的氨基酸22-586、SEQIDNO:179中的氨基酸20-582，(b)由核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列(i)在至少低严紧条件下与SEQIDNO:13中的核苷酸1-1326、SEQIDNO:17中的核苷酸1-1413、SEQIDNO:19中的核苷酸1-1350、SEQIDNO:21中的核苷酸1-1338、SEQIDNO:25中的核本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽，其包含含有催化模块的第一氨基酸序列和含有碳水化合物结合模块的第二氨基酸序列，其中所述催化模块具有α‑淀粉酶活性，其中所述第二氨基酸序列与选自下组的任一氨基酸序列具有至少60％的同源性：SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:143。

【技术特征摘要】
2004.12.22 US 60/638,614;2005.02.07 US 60/650,6121.一种多肽，其包含含有催化模块的第一氨基酸序列和含有碳水化合物结合模块的第二氨基酸序列，其中所述催化模块具有α-淀粉酶活性，其中所述第二氨基酸序列与选自下组的任一氨基酸序列具有至少60％的同源性：SEQIDNO:52、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90、SEQIDNO:92、SEQIDNO:94、SEQIDNO:96、SEQIDNO:98、SEQIDNO:109、SEQIDNO:137、SEQIDNO:139、SEQIDNO:141和SEQIDNO:143。2.权利要求1的多肽，其中所述第一氨基酸序列与选自下组的任一氨基酸序列具有至少60％的同源性：SEQIDNO:02、SEQIDNO:04、SEQIDNO:06、SEQIDNO:08、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42、SEQIDNO:44、SEQIDNO:111、SEQIDNO:113、SEQIDNO:115、SEQIDNO:117、SEQIDNO:119、SEQIDNO:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127、SEQIDNO:129、SEQIDNO:131、SEQIDNO:133、SEQIDNO:135和SEQIDNO:155。3.权利要求1或2的多肽，其中在所述第一和所述第二氨基酸序列之间的位置存在接头序列，所述接头序列与选自下组的任一氨基酸序列具有至少60％的同源性：SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:145、SEQIDNO:147、SEQIDNO:149、SEQIDNO:151和SEQIDNO:52。4.权利要求1-3任一权利要求的多肽，其中所述第一氨基酸序列与SEQIDNO:4所示氨基酸序列具有至少60％的同源性，并且其中所述第一氨基酸序列包含选自下组的一个或多个氨基酸取代：A128P、K138V、S141N、Q143A、D144S、Y155W、E156D、D157N、N244E、M246L、G446D、D448S和N450D。5.权利要求4的多肽，其中所述多肽具有SEQIDNO:100所示的氨基酸序列或者与SEQIDNO:100所示氨基酸序列具有至少60％同源性的氨基酸序列。6.权利要求1-3任一权利要求的多肽，其中所述多肽具有SEQIDNO:101所示的氨基酸序列或者与SEQIDNO:101所示氨基酸序列具有至少60％同源性的氨基酸序列。7.权利要求1-3任一权利要求的多肽，其中所述多肽具有SEQIDNO:102所示的氨基酸序列或者与SEQIDNO:102所示氨基酸序列具有至少50％同源性的氨基酸序列。8.权利要求1-7任一权利要求的多肽，其中所述多肽是杂合体。9.具有α-淀粉酶活性的多肽，选自下组：(a)一种多肽，其具有与成熟多肽的氨基酸有至少75％同源性的氨基酸序列，所述成熟多肽的氨基酸选自下组：SEQIDNO:14中的氨基酸1-441、SEQIDNO:18中的氨基酸1-471、SEQIDNO:20中的氨基酸1-450、SEQIDNO:22中的氨基酸1-445、SEQIDNO:26中的氨基酸1-498、SEQIDNO:28中的氨基酸18-513、SEQIDNO:30中的氨基酸1-507、SEQIDNO:32中的氨基酸1-481、SEQIDNO:34中的氨基酸1-495、SEQIDNO:38中的氨基酸1-477、SEQIDNO:42中的氨基酸1-449、SEQIDNO:115中的氨基酸1-442、SEQIDNO:117中的氨基酸1-441、SEQIDNO:125中的氨基酸1-477、SEQIDNO:131中的氨基酸1-446、SEQIDNO:157中的氨基酸41-481、SEQIDNO:159中的氨基酸22-626、SEQIDNO:161中的氨基酸24-630、SEQIDNO:163中的氨基酸27-602、SEQIDNO:165中的氨基酸21-643、SEQIDNO:167中的氨基酸29-566、SEQIDNO:169中的氨基酸22-613、SEQIDNO:171中的氨基酸21-463、SEQIDNO:173中的氨基酸21-587、SEQIDNO:175中的氨基酸30-773、SEQIDNO:177中的氨基酸22-586、SEQIDNO:179中的氨基酸20-582。(b)由核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列(i)至少在低严紧条件下与SEQIDNO:13中的核苷酸1-1326、SEQIDNO:17中的核苷酸1-1413、SEQIDNO:19中的核苷酸1-1350、SEQIDNO:21中的核苷酸1-1338、SEQIDNO:25中的核苷酸1-1494、SEQIDNO:27中的核苷酸52-1539、S...

【专利技术属性】
技术研发人员：福山志朗，松井知子，宋子良，埃里克·阿兰，安德斯·维克索尼尔森，宇田川裕晃，刘晔，段俊欣，吴文平，利尼·N·安德森，萨拉·兰德维克，
申请(专利权)人：诺维信公司，诺维信北美公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK