本发明专利技术涉及包括糖－结合模块氨基酸序列和真菌ａｌｐｈａ－淀粉酶氨基酸序列的杂交酶，并涉及包括糖－结合模块和ａｌｐｈａ－淀粉酶催化模块的真菌野生型酶的变体。本发明专利技术也涉及所述的杂交酶或所述的变体在淀粉液化中的用途。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术尤其涉及包含糖-结合模块(carbohydrate-binding module)(“CBM”)和alpha-淀粉酶催化结构域的酶。所述的酶可为糖-结合模块(“CBM”)和alpha-淀粉酶之间的杂合体或为包含糖-结合模块(“CBM”)和alpha-淀粉酶催化结构域的亲代酶的变体。本专利技术也涉及所述的酶在淀粉液化过程中的用途，在所述淀粉液化过程中淀粉被降解为较小的寡糖和/或多糖片段。
技术介绍
已经描述了很多酶和过程用于将淀粉转化为淀粉水解物，诸如麦芽糖、葡萄糖或特制糖浆，用作甜味剂或作为其它糖类如果糖的前体。葡萄糖也可发酵为乙醇或其它发酵产物，诸如柠檬酸、谷氨酸单钠、葡糖酸、葡糖酸钠、葡糖酸钙、葡糖酸钾、葡糖酸delta内酯，或异抗坏血酸钠、衣康酸、乳酸、葡糖酸；酮类；氨基酸、谷氨酸(单谷氨酸钠(sodium monoglutaminate))、青霉素、四环素；酶；维生素，诸如核黄素、B12、beta-胡萝卜素或激素。淀粉是高分子量聚合物，其由葡萄糖单元的链组成。它通常由大约80％支链淀粉和20％直链淀粉组成。支链淀粉是分枝的多糖，其中alpha-1，4D-葡萄糖残基的直链通过alpha-1，6糖苷键连接。直链淀粉是直链的多糖，其由通过alpha-1，4糖苷键连接在一起的D-吡喃葡萄糖单元组成。在将淀粉转化为可溶的淀粉水解物的情况，所述的淀粉被解聚(depolymerize)。常规的解聚过程由凝胶化步骤和两个连续的处理步骤，即液化处理和糖化处理组成。颗粒状淀粉由微小的颗粒组成，其在室温不溶于水。当加热水性的淀粉浆体时，所述的颗粒膨胀并最终胀破，将所述的淀粉分子分散到所述溶液中。在此“凝胶化”处理过程中，粘度有显著的提高。由于在通常的工业过程中，所述的固体水平为30-40％，就必须将所述的淀粉变稀薄和“液化”，以使其能被处理。此粘度的降低现今主要通过酶法降解获得。在液化步骤中，所述的长链淀粉被alpha-淀粉酶降解为较小的分枝的和线状的单元(麦芽糖糊精)。所述的液化步骤通常在大约105-110℃进行大约5至10分钟，然后在大约95℃进行大约1-2小时。然后将温度降低到60℃，加入葡糖淀粉酶或beta-淀粉酶和任选的脱支酶，诸如异淀粉酶或支链淀粉酶，而且所述糖化处理进行大约24至72小时。由前面的讨论显然，由于依据不同的步骤中温度的不同要求，常规的淀粉转化方法是非常消耗能量的。因此就需要能够选择和/或设计用于此方法的酶，可以进行全过程而无需将所述淀粉凝胶化。这样的方法是专利US4591560、US4727026和US4009074和EP0171218，以及丹麦专利申请PA2003 00949的主题。本专利技术公开新的杂交酶和设计用于所述方法并包含CBM的氨基酸序列和真菌淀粉降解酶的氨基酸序列的野生型酶的遗传修饰。杂交酶是WO9814601、WO0077165和丹麦专利申请PA 2003 00949的主题。
技术实现思路
本专利技术在第一个方面提供了杂交酶(hybrid enzyme)，其包含具有alpha-淀粉酶活性的催化模块的氨基酸序列和糖-结合模块的氨基酸序列，其中所述的催化模块是真菌来源的。本专利技术在第二个方面提供了SEQ ID NO41所示的真菌alpha-淀粉酶的变体或与SEQ ID NO41具有至少60％同源性、至少70％同源性、至少80％同源性或甚至至少90％同源性的alpha-淀粉酶的变体，其中所述的变体在一个或多个下列位置包含改变13、15、18、31、32、33、34、35、36、61、63、64、68、69、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、89、117、118、119、120、121、122、123、124、125、152、153、154、155、156、157、158、161、162、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、204、205、206、207、208、209、210、211、216、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、242、245、250、252、253、255、256、257、259、260、275、292、295、296、297、298、299、304、328、339、344、348、378、383、386、387、405、448和480其中；(a)所述的变化独立地，i)插入占据所述位置的氨基酸的氨基酸下游，ii)缺失占据所述位置的氨基酸，或iii)用不同的氨基酸取代占据所述位置的氨基酸，b)所述的变体相对于所述亲代真菌alpha-淀粉酶具有增加的酸性alpha-淀粉酶活性和或改进的酶稳定性和，(c)每个位置对应于SEQ ID NO43中所示的TAKA淀粉酶和/或SEQ IDNO41中所示的川地曲霉alpha-淀粉酶的氨基酸序列的位置。在又一方面，本专利技术提供了分离的DNA序列，其编码第一方面的杂交酶或第二方面的变体，包含编码第一方面的杂交酶或第二方面的变体的DNA序列的DNA构建体，包含编码第一方面的杂交酶或第二方面的变体的DNA序列的表达载体，和用载体转化的宿主细胞；其中所述的宿主细胞能够表达编码第一方面的杂交酶或第二方面的变体的DNA序列。在第八个方面，本方面提供了用于液化淀粉的方法，其中凝胶化的或颗粒状的淀粉底物在水介质中用第一方面的杂交酶或第二方面的变体处理。专利技术详述术语“颗粒状淀粉”理解为生的未烹调过的淀粉，即未经过凝胶化的淀粉。淀粉作为不可溶于水的微小颗粒在植物中形成。这些颗粒在低于初始凝胶化温度的温度保留在淀粉中，当将其置于冷水中时，淀粉颗粒可吸收少量的液体。在温度高达50℃至70℃时，所述的膨胀是可逆的。可逆性的程度依赖于具体的淀粉。在更高的温度下，被称为凝胶化的不可逆膨胀开始。术语“初始凝胶化温度”理解为淀粉的凝胶化开始发生的最低温度。在水中加热的淀粉在50℃-75℃开始凝胶化；凝胶化的准确温度依赖于具体的淀粉，并能够由本领域的技术人员容易地确定。这样，初始凝胶化温度可根据植物种类、植物种类的具体品种以及生长条件而变化。在本专利技术的上下文中，给出的淀粉的初始凝胶化温度是应用Gorinstein.S.和Lii.C.，Starch/St_rke，Vol.44(12)pp.461-466(1992)描述的方法，淀粉颗粒的双折射(birefringence)损失5％时的温度。术语“可溶的淀粉水解产物”理解为本专利技术的方法的可溶的产物，并可以包括单糖、二糖和寡糖，如葡萄糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、环糊精和这些的任意混合物。优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％的颗粒状淀粉的干固体被转化为可溶的淀粉水解产物。术语多肽“同源性”理解为指示第一个序列与第二个序列差异(derivation)的两个序列之间的同一性(identity)程度。同源性可通过本领域公知的计算机程序适合地确定，所述的计算机程序如GCG程序包中提供的GAP(ProgramManual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，Genetics ComputerG本文档来自技高网...
【技术保护点】
杂交酶，其包括催化模块的氨基酸序列和糖结合模块的氨基酸序列， ａ）其中所述催化模块是氨基酸序列，其与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８的氨基酸序列具有至少７０％同源性或与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０的氨基酸序列具有至少７０％同源性； ｂ）其中所述糖结合模块氨基酸序列，其与选自ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５的氨基酸序列具有至少５０％同源性。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：平理佳子，高木忍，卡斯滕约尔特，安德斯维克索尼尔森，埃里克阿兰，宇田川裕晃，福山志朗，
申请(专利权)人：诺维信公司，诺维信北美公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]
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