【技术实现步骤摘要】
专利
本专利技术涉及相对于亲本蛋白酶在一种或多种特性中展示出改变的新颖蛋白酶变体，所述特性包括：清洗性能、洗涤剂稳定性和/或储存稳定性。本专利技术的变体适合用于在清洁过程和洗涤剂组合物中使用，如洗衣组合物和餐具清洗组合物，包括手洗和自动餐具清洗组合物。本专利技术还涉及编码这些变体的分离的dna序列、表达载体、宿主细胞以及用于产生和使用本专利技术的蛋白酶变体的方法。相关技术说明酶作为清洗配制品的部分已经在洗涤剂工业使用了数十年。从商业视角看，蛋白酶在这样的配制品中是最相关的酶，而其他酶(包括脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶或多种酶的混合物)也是通常使用的。为了改进蛋白酶的成本和/或性能，对具有改变的特性，如在低温下增加的活性、增加的稳定性、在给定的ph下增加比活性、改变的ca2+依赖性、在其他洗涤剂成分(例如漂白剂、表面活性剂等)的存在下增加的稳定性等的蛋白酶进行着持续搜寻。广泛用于洗涤剂中的一个蛋白酶家族是枯草杆菌酶。这个家族先前已经进一步由西埃泽恩(siezen)rj和洛因伊森(leunissen)jam，1997，蛋白质科学(proteinscience)，6，501-523被分组为6个不同亚组。这些亚组之一是枯草杆菌蛋白酶家族，它包括枯草杆菌酶，如bpn’、枯草杆菌蛋白酶309(诺维信公司(novozymes a/s))、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(carlsberg)(诺维信公司)、枯草杆菌蛋白酶41(来自嗜冷的南极芽孢杆菌ta41的一种枯草杆菌酶，戴韦尔(davail)s等人1994，生化杂志(thejournal of biologic
技术介绍
技术实现思路
0、专利技术概述
1、本专利技术涉及蛋白酶变体，其包括一个或多个选自下组的改变，该组由以下各项组成：a1l、a1*、v2i、p3*、s4*、s4c、q6c、q18a、l43i、e50q、n59l、l61k、v62g、g64a、g64s、s65f、q70t、q70l、q70n、q70y、q70f、q70m、q70a、q70v、q97k、g107n、*108aa、n109t、*109aa、n109a、s111i、s111r、y113s、s114v、s114a、s114f、d126g、d126k、e127r、e127q、s133h、i137n、m139l、s143r、s144p、s144r、a145e、l149r、l149t、i150l、i150t、i150s、i150v、v162s、v162e、v162q、v162g、v162f、v162t、v162y、i164m、s171d、g182a、g182s、q198e、q198d、g200c、g200s、a233s、t246m、a267s、s274v、q275y、l276i、以及t297p，其中这些位置对应于seq id no:3的位置，并且其中该蛋白酶变体与seq id no:3具有至少60％的序列一致性，并且该变体具有蛋白酶活性。
2、本专利技术还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸，包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生这些变体的方法。
3、所列序列的综述
4、seq id no:1＝是从芽孢杆菌属物种分离的ty-145蛋白酶的dna序列
5、seq id no:2＝是如从seq id no:1推导的氨基酸序列。
6、seq id no:3＝是成熟ty-145蛋白酶的氨基酸序列。
7、seq id no:4：＝是ty-145蛋白酶+s173p+s175p的氨基酸序列
8、seq id no:5：＝是ty-145蛋白酶+s173p+s175p+f180y的氨基酸序列定义
9、术语“蛋白酶”在此被定义为水解肽键的酶。它包括属于ec 3.4酶组的任何酶(包括其13个亚类中的每一种http://en.wikipedia.org/wiki/category:ec_3.4)。ec编号参考加利福尼亚州(california)的圣迭戈(san diego)的nc-iubmb学术出版社(academicpress)的1992年酶命名法，分别包括出版于欧洲生物化学期刊(eur.j.biochem.)1994，223，1-5、欧洲生物化学期刊1995，232，1-6、欧洲生物化学期刊1996，237，1-5、欧洲生物化学期刊1997，250，1-6、以及欧洲生物化学期刊1999，264，610-650的增刊1-5。术语“枯草杆菌酶”是指根据斯艾森(siezen)等人，蛋白质工程学(proteinengng.)4(1991)719-737和斯艾森(siezen)等人，蛋白质科学(protein science)6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的一个亚组。另外，枯草杆菌酶(以及丝氨酸蛋白酶)的特征为除了丝氨酸以外，具有两个活性位点氨基酸残基，即组氨酸和天冬氨酸残基。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(thermitase)家族、蛋白酶k家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶(lantibiotic peptidase)家族、kexin家族和pyrolysin家族。术语“蛋白酶活性”意指蛋白水解活性(ec 3.4)。本专利技术的蛋白酶是内肽酶(ec3.4.21)。出于本专利技术的目的，根据以下“材料与方法”所述的程序确定蛋白酶活性。本专利技术的这些蛋白酶变体具有seq id no:3的多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的蛋白酶活性。
10、术语“亲本”、“蛋白酶亲本”、或“前体蛋白酶”意指蛋白酶，对其进行了改变以产生本专利技术的酶变体。因此，亲本是具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置处不具有改变的一种蛋白酶。应理解的是，在上下文中的“具有一致的氨基酸序列”的表达涉及100％序列一致性。该亲本可以是天然存在的(野生型)多肽。在具体实施例中，该亲本是与在seq id no:3中示出的多肽具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少70％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种蛋白酶变体，其包括一个或多个选自下组的改变，该组由以下各项组成：A1L、A1*、V2I、P3*、S4*、S4C、Q6C、Q18A、L43I、E50Q、N59L、L61K、V62G、G64A、G64S、S65F、Q70T、Q70L、Q70N、Q70Y、Q70F、Q70M、Q70A、Q70V、Q97K、G107N、*108aA、N109T、*109aA、N109A、S111I、S111R、Y113S、S114V、S114A、S114F、D126G、D126K、E127R、E127Q、S133H、I137N、M139L、S143R、S144P、S144R、A145E、L149R、L149T、I150L、I150T、I150S、I150V、V162S、V162E、V162Q、V162G、V162F、V162T、V162Y、I164M、S171D、G182A、G182S、Q198E、Q198D、G200C、G200S、A233S、T246M、A267S、S274V、Q275Y、L276I、以及T297P，其中这些位置对应于SEQ ID NO:3的位置，并且其中该蛋白酶变体与SEQ
2.如权利要求1所述的蛋白酶变体，相比于该亲本或相比于具有SEQ ID NO:3的蛋白酶，该蛋白酶变体具有改进的洗涤剂稳定性。
3.如权利要求1-2中任一项所述的蛋白酶变体，其中该变体选自下组，该组由以下各项组成：
4.如权利要求1-3中任一项所述的蛋白酶变体，其中该变体与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性。
5.如权利要求1-4中任一项所述的蛋白酶变体，其中该变体选自下组，该组由以下变体组成：
6.一种洗涤剂组合物，其包括根据权利要求1至5中任一项所述的变体。
7.如权利要求6所述的洗涤剂组合物，其进一步包括一种或多种洗涤剂组分。
8.根据权利要求6-7中任一项所述的洗涤剂组合物，其进一步包括一种或多种选自下组的另外的酶，该组由以下各项组成：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧合酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶，或其任何混合物。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的洗涤剂组合物，其处于棒，均匀的片剂，具有两层或更多层的片剂，具有一个或多个室的袋，规则的或压缩的粉末，颗粒，糊，凝胶，或规则的、压缩的或浓缩的液体的形式。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的洗涤剂组合物在清洁过程如洗衣或硬表面清洁如餐具清洗中的用途。
11.一种用于获得蛋白酶变体的方法，该方法包括向亲本蛋白酶中引入一个或多个以下的改变：SEQ ID NO 3的A1L、A1*、V2I、P3*、S4*、S4C、Q6C、Q18A、L43I、E50Q、N59L、L61K、V62G、G64A、G64S、S65F、Q70T、Q70L、Q70N、Q70Y、Q70F、Q70M、Q70A、Q70V、Q97K、G107N、*108aA、N109T、*109aA、N109A、S111I、S111R、Y113S、S114V、S114A、S114F、D126G、D126K、E127R、E127Q、S133H、I137N、M139L、S143R、S144P、S144R、A145E、L149R、L149T、I150L、I150T、I150S、I150V、V162S、V162E、V162Q、V162G、V162F、V162T、V162Y、I164M、S171D、G182A、G182S、Q198E、Q198D、G200C、G200S、A233S、T246M、A267S、S274V、Q275Y、和L276I，其中该变体具有与SEQ ID NO:3至少70％一致的氨基酸序列，并且回收该变体。
12.如权利要求11所述的方法，其中该变体包括对应于SEQ ID NO:3的成熟多肽的位置1、2、3、4、6、18、43、50、59、61、62、64、65、70、107、108、109、111、113、114、126、127、133、137、139、143、144、145、149、150、162、164、171、182、198、200、233、246、267、274、275、或276的两个、三个、四个、或五个取代。
13.根据权利要求11-12中任一项所述的方法，其中该蛋白酶变体与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少75％，如至少8...
【技术特征摘要】
1.一种蛋白酶变体，其包括一个或多个选自下组的改变，该组由以下各项组成：a1l、a1*、v2i、p3*、s4*、s4c、q6c、q18a、l43i、e50q、n59l、l61k、v62g、g64a、g64s、s65f、q70t、q70l、q70n、q70y、q70f、q70m、q70a、q70v、q97k、g107n、*108aa、n109t、*109aa、n109a、s111i、s111r、y113s、s114v、s114a、s114f、d126g、d126k、e127r、e127q、s133h、i137n、m139l、s143r、s144p、s144r、a145e、l149r、l149t、i150l、i150t、i150s、i150v、v162s、v162e、v162q、v162g、v162f、v162t、v162y、i164m、s171d、g182a、g182s、q198e、q198d、g200c、g200s、a233s、t246m、a267s、s274v、q275y、l276i、以及t297p，其中这些位置对应于seq id no:3的位置，并且其中该蛋白酶变体与seq id no:3具有至少60％的序列一致性，并且该变体具有蛋白酶活性。
2.如权利要求1所述的蛋白酶变体，相比于该亲本或相比于具有seq id no:3的蛋白酶，该蛋白酶变体具有改进的洗涤剂稳定性。
3.如权利要求1-2中任一项所述的蛋白酶变体，其中该变体选自下组，该组由以下各项组成：
4.如权利要求1-3中任一项所述的蛋白酶变体，其中该变体与seq id no:3的成熟多肽具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性。
5.如权利要求1-4中任一项所述的蛋白酶变体，其中该变体选自下组，该组由以下变体组成：
6.一种洗涤剂组合物，其包括根据权利要求1至5中任一项所述的变体。
7.如权利要求6所述的洗涤剂组合物，其进一步包括一种或多种洗涤剂组分。
8.根据权利要求6-7中任一项所述的洗涤剂组合物，其进一步包括一种或多种选自下组的另外的酶，该组由以下各项组成：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧合酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶，或其任何混合物。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的洗涤剂组合物，其处于棒，均匀的片剂，具有两层或更多层的片剂，具有一个或多个室的袋，规则的或压缩...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·D·G·P·托斯卡诺，E·P·弗里斯，BM·卢，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：
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