一种用于快速检测Ⅰ型糖尿病的融合蛋白制造技术

本发明专利技术是一种用于快速检测Ⅰ型糖尿病的融合蛋白。所述融合蛋白质为胰岛细胞自身抗原(ICA69)基因和谷氨酸脱羧酶(GAD2)基因通过融合表达获得的ICA‑GAD融合蛋白质。本发明专利技术包括以下步骤：通过DNA star软件对胰岛细胞抗体(ICA69)基因和谷氨酸脱羧酶(GAD2)基因进行B细胞抗原表位分析并确定其基因序列，通过人工合成目的基因(ICA‑GAD)，将目的基因插入蛋白表达载体pet28a中，然后转化到BL21(DE3)宿主菌中，加入IPTG对目标蛋白进行诱导表达；用Ni柱和透析袋纯化分离出表达蛋白；对ICA‑GAD融合蛋白的活性进行检测。本发明专利技术能够一次性检测抗体中的任意一种或两种，显著提高I型糖尿病的诊断效率，缩短检测时间，降低医疗费用。

A fusion protein for rapid detection of type I diabetes mellitus

The present invention is a fusion protein for rapid detection of type I diabetes mellitus. The fusion protein for islet cell autoantigen (ICA69) gene and glutamate decarboxylase (GAD2) gene expression obtained by fusion ICA GAD fusion protein. The invention comprises the following steps: through DNA Star Software on the islet cell antibody (ICA69) gene and glutamate decarboxylase (GAD2) gene of B cell epitope analysis and determine its gene sequence by synthetic gene (ICA GAD), the target gene was inserted into expression vector pET28a, then transformed into BL21 (DE3) host, joined the IPTG on the target protein expression was induced by Ni column and dialysis bag; separation and purification of expressed protein; to detect ICA fusion protein GAD activity. The invention can detect any or two antibodies at once, and can significantly improve the diagnostic efficiency of I type diabetes, shorten the detection time and lower the medical expenses.

【技术实现步骤摘要】
一种用于快速检测I型糖尿病的融合蛋白
本专利技术涉及一种用于快速检测I型糖尿病的融合蛋白，特别是ICA69和GAD2融合表达的ICA-GAD融合蛋白

技术介绍
目前，随着人们生活水平的提高，使人们糖摄入量高，加上运动量少，导致部分人因过度肥胖诱发糖尿病。糖尿病是一种常见的以高血糖为特征的内分泌代谢疾病，是由于胰岛素分泌缺陷或其生物性能受损而导致的血糖过高，出现糖尿，进而引起脂肪和蛋白质代谢紊乱，导致各组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经性的慢性损害、功能障碍。糖尿病分为四种类型，即I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病和其他特殊类型糖尿病。在I型糖尿病的免疫破坏期间，患者体内会自动产生针对于胰岛细胞自身抗原的抗体。目前已经发现多种胰岛素自身抗体，如：胰岛细胞抗体(ICA)、胰岛细胞表面抗体(ICSA)、胰岛素抗体(IAA)、热休克蛋白抗体(HSP)、谷氨酸脱羧酶65抗体(GAD65，哺乳动物中GAD的存在形式之一)、蛋白质酪氨酸磷酸酶抗体(IA-2A)等。临床上在诊断I型糖尿病常用的指标包括ICA、IAA、GAD、IA-2A等。目前只能对于I型糖尿病病人中ICA、IAA、GAD、IA-2A等多个自身抗体进行单一测定，步骤繁多且花费较高，效率低，特异性不足，时间长等缺点。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对现有现状，提供一种用于快速检测I型糖尿病的ICA-GAD融合蛋白，这种方法可以一次性检测出抗ICA69和GAD2任意一种或两种抗体。这种方法方便、简捷、高效，降低医疗成本和检测时长。本专利技术是通过以下技术方案实现的，具体包括以下步骤：(1)合成目的基因(ICA-GAD)，将目的基因插入蛋白表达载体pet28a中，然后转化到BL21(DE3)宿主菌中，加入IPTG进行目标蛋白的诱导表达；(2)用Ni柱和透析袋纯化分离出表达蛋白；(3)对ICA-GAD融合蛋白的活性进行检测。所述的步骤(1)所述的目标蛋白为ICA69基因和GAD2基因通过融合表达获得的蛋白质，其特征在于其氨基酸序列：SEQIDNO：4。所述的步骤(1)所述目的基因的合成是选自ICA69和GAD2的基因序列直接进行合成的：SEQIDNO：3所示。所述的步骤(1)所述的蛋白表达宿主是BL21(DE3)。所述的步骤(3)中所述的融合蛋白活性的检测包括抗原的包被、加样、加酶标抗体、加底物液显色、终止反应、结果判定。抗原的包被：用0.05MPH9，碳酸盐包被缓冲液将融和蛋白ICA-GAD稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟；加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml，37℃孵育0.5～1小时，洗涤。加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB(四甲基联苯胺)底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色剂，于410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。附图说明图1.载体构建图1中A部分为PET-28a载体图，其中BamHI和XhoI为酶切位点；B部分为ICA-GAD目标基因图，其中BamHI和XhoI为酶切位点；C部分为插入ICA-GAD目标基因之后的载体图。具体实施方式实施例一：基因的融合与表达(1)目的DNA序列进行人工合成。(2)目标基因的PCR扩增：为确保得到两者融和表达，利用Primer5.0根据目标基因序列设计特异性扩增引物，引物设计以BamHI和XhoI为酶切位点。引物序列为：cgggatccatggcatctccgggctctggcttttggtctSEQIDNO：1ccctcgagtcatgcattgagcaattcgtggttcSEQIDNO：2用高保真DNA扩增系统以合成的DNA序列为模板进行PCR循环获得产物。(3)扩增后，按照AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒对目的基因片段进行回收。将目的基因插入载体中：cDNA产物与载体进行连接，转化到PET-28a载体中，根据重组载体的标志(抗Kan或蓝白斑)作筛选，挑取单斑，进行菌液PCR和双酶切并测序进行阳性验证。将此重组质粒DNA转化到表达宿主菌的感受态细胞BL21(DE3)并涂布于LB培养基平板上。(4)蛋白表达：挑选含重组质粒的菌体单斑至LB(Kan100ug/ml)液体培养基中37℃过夜培养。按1∶50比例稀释过夜菌，，37℃振荡培养至OD600值在0.4-1.0(最好0.6，大约3小时)。取部分菌液作为诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组，两组继续37℃振荡培养3小时。实施例二：蛋白纯化诱导的含有目的蛋白的细菌被离心收集，超声破菌，离心收集上清。为了提高目的蛋白的纯化纯度，我们对传统的纯化his融合蛋白的方法进行了相关的改进，在诱导表达后的大肠杆菌上清中加入β-巯基乙醇(使终浓度为5mM)。然后利用含有300mMNacl，20mMTris-Hcl和40mM的咪唑缓冲液把目的蛋白结合到HISTrapFF亲和柱子上，然后用含有300mMNacl，20mMTris-Hcl和500mM的咪唑缓冲液把目的蛋白洗脱下来。在PBS缓冲液中4℃透析过夜，BCA法测定蛋白浓度为1mg/ml。实施例三：利用Elisa检测来测定免疫活性。1.包被：用0.05MPH9，碳酸盐包被缓冲液将融和蛋白ICA-GAD稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml，37℃孵育0.5～1小时，洗涤。4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB(四甲基联苯胺)底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色剂，于410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。ELISA试剂盒检测结果G.实施效果：本专利技术提高了I型糖尿病的检出率，在所测的样品中，每个样品只要有抗ICA69和GAD2抗体中的一种或两种存在，显著提高I型糖尿病的诊断效率，可用于制作检测I型糖尿病试剂盒。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于快速检测I型糖尿病的融合蛋白。所述ICA‑GAD融合蛋白质为胰岛细胞自身抗原(ICA69)基因和谷氨酸脱羧酶(GAD2)基因通过融合表达获得的ICA‑GAD融合蛋白质。本专利技术包括以下步骤：合成目的基因(ICA‑GAD)，将目的基因插入蛋白表达载体pet28a中，然后转化到BL21(DE3)宿主菌中，加入IPTG进行目标蛋白的诱导表达；用Ni柱和透析袋纯化分离出表达蛋白；对ICA‑GAD融合蛋白的活性进行检测。

【技术特征摘要】
1.一种用于快速检测I型糖尿病的融合蛋白。所述ICA-GAD融合蛋白质为胰岛细胞自身抗原(ICA69)基因和谷氨酸脱羧酶(GAD2)基因通过融合表达获得的ICA-GAD融合蛋白质。本发明包括以下步骤：合成目的基因(ICA-GAD)，将目的基因插入蛋白表达载体pet28a中，然后转化到BL21(DE3)宿主菌中，加入IPTG进行目标蛋白的诱导表达；用Ni柱和透析袋纯化分离出表达蛋白；对ICA-GAD融合蛋白的活性进行检测。2.根据权利要求1所述的一种用于快速检测I型糖尿病的ICA-GAD融合蛋白，所述融合蛋白质为ICA69基因和GAD...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗朝领，冯奇，马贵芳，杜庆辉，茅柳娟，
申请(专利权)人：上海领潮生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31