本发明专利技术属于生物工程技术领域，基于目前国内外抗体快速检测领域普遍存在的抗原水溶性差、检测信号弱、灵敏度低、特异性差等问题，本发明专利技术提出直接采用携带融合标签的整体融合蛋白质进行分析物的平面流动型快速检测。1.本发明专利技术的要点是：构建融合蛋白重组基因；表达并纯化重组融合蛋白质；用重组融合蛋白质制备检测试剂和捕获试剂。2.本发明专利技术显示，融合蛋白质具备水溶性好、易于纯化、具备天然构型、活性高、标记效率高等优点，由此制成的快速检测试剂灵敏度和特异性高。3.根据本发明专利技术组建的快速检测试剂能够检测一种或者同时检测两种分析物。4.本发明专利技术在疾病诊断、流行病普查、医学鉴定、新药研制、农牧兽医等应用和基础研究领域具备广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，具体地说涉及直接采用携带融合标签的整体融合蛋白质进行快速诊断检测。
技术介绍
检测人类等生物样本中特定蛋白质因子的含量，对于医学、生物学、农牧业等领域的基础研究和实际应用具有非常重要的意义。例如，检测人体血液中针对丙型肝炎等致病病毒特异性抗体的存在，是目前诊断这些传染病的主要手段。同样，测定癌症和心血管疾病的早期生物标记蛋白质因子含量的变化对于这些疾病的早发现早治疗和疗效观察极为重要。随着医学和生物学领域的不断进展，各种蛋白质检测方法应运而生，其中最方便、应用范围最广也是目前使用最多的是各种免疫检测技术，例如免疫沉淀、免疫组织化学、和酶联免疫吸附检测(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA)和快速免疫检测技术等。虽然ELISA比较简便常用，可以定量，但是耗时较长，一般需要4-5小时或者过夜，而且花费较高，需要特定的读测仪器和受过专门训练的工作人员才能完成。而实际工作中往往不具备这些检测条件，或需要立即知道检测结果，因此ELISA的广泛应用受到很大限制。 而近年来基于平面流动技术发展起来的快速免疫检测方法，因其操作简单、费用低、耗时短 (仅需15-20分钟就可以看到结果)，无论在国内外，在农村还是城市都比ELISA方法具备优势和发展前景。基于此，世界卫生组织(WHO)于2005年提出采用快速检测技术检测禽流感等各类流行性感冒病毒。同时，美国疾病防治中心(CDC)也于2004年建议采用快速检测技术对怀孕妇女和医护工作人员普遍检查人类免疫缺陷病毒(HIV)的感染情况。快速免疫检测主要有两类方法。一类方法是检测样本中某一特异性抗原，例如检测人体血液中的乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原或表面抗原，这类方法需要亲和力高、信号强、特异性好的相应抗体作为主要检测试剂。另一类方法是检测样本(通常是血液)中针对某一抗原的特异性抗体，例如检测人体血液中针对HIV或者丙型肝炎病毒(HCV)的抗体， 这类方法需要纯度高、溶解性好、信号强、特异性专一的相应抗原分子或抗原片段作为主要检测试剂。图1展示针对抗体的快速检测试剂组件。以检测人体血样中HCV抗体为例，在加样处加入血液样品，通过扩散渗透作用经过玻璃纤维到达存放干燥的金标-抗原(本例为HCV核心蛋白)位置，使之溶解。如果血样中存在抗HCV抗体，则这些抗体将与金标抗原结合，形成抗体-金标抗原复合物，继续沿硝酸纤维膜向吸水纸方向移动。到达检测线区域时，与检测线上的固相抗原结合，其中的金标抗原在此处富集而显示阳性反应信号。未结合的金标抗原在质控线区域被此处的固相HCV抗体捕获而显示质量控制信号。如果血样中不含HCV抗体，则金标抗原不能在检测线上富集显色，但是能够在质控线富集显色而呈阴性反应(图1)。目前国内外针对抗体的快速检测方法和相应试剂普遍存在着检测灵敏度较低的问题，无法有效地检测抗体含量较低的血样，这在我国国内产品中表现尤甚。以HCV抗体快速检测试剂为例，国内一家公司产品对HCV阳性血样的检出率仅为22. 5%。造成这一问题的主要原因有(1)用来作为抗原的蛋白质通常在微生物蛋白质表达系统例如大肠杆菌中产生。由于改变了蛋白质表达的外部环境，许多本来水溶性蛋白质由于形成内含体 (inclusion body)等原因，在大肠杆菌中表达后水溶性很差，需要特殊的促溶性处理(比如用高浓度尿素溶解，或者用亚硝基胍使蛋白质变性后再复性)才能用作抗原；而这些促溶性处理除了增加成本、耗费时间、降低产量之外，还不可避免地导致抗原蛋白质产物的不均一性和分子构型及其识别相应抗体特性的改变。(2)实际工作中，用做抗原的蛋白质本身分子量可能很小，而且，为了规避非特异性结合，常常只表达抗原蛋白质的某一段序列(结构域)用作抗原。其分子量就更加小，进行胶体金标记时效果较差，使检测信号微弱，即便有阳性反应，也因为信号过弱而观察不到。为了克服上述问题，人们提出了一些解决方法，比如通过选择表达抗原蛋白质序列、尝试各种途径促进蛋白质水溶性、改变用于金标的胶体金颗粒大小、提高金标标记效率、采用生物素-链亲和素(biotin-str印tavidin)系统放大检测信号等等。这些方法虽然有一定效果，然而，到目前为止，快速免疫检测方法灵敏度低的问题仍然没有得到根本改口 ο而另一方面，随着分子生物学、基因组学和蛋白质组学研究的深入进行，蛋白质表达和纯化技术也有了长足的发展。为了提高重组蛋白质的水溶性，方便蛋白质纯化，人们将特定功能多肽标签(结构域)的编码序列植入所研究基因序列内，形成融合基因，表达产生融合蛋白质。其中多聚组氨酸标签(His-tag)等序列较短，主要用于重组蛋白质的纯化； 而谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferase，GST)和麦芽糖结合蛋白(Maltose bindingprotein,MBP)等融合蛋白质序列较长，除了方便纯化之外，还能够提高重组蛋白质的水溶性。这一方面归功于GST和MBP本身的极佳亲水性提高了整个重组融合蛋白质的水溶性；另一方面，这些融合蛋白序列能够帮助重组融合蛋白质的在翻译后的正确折叠形成可溶的天然构型。如果需要，可以将这些标签或融合蛋白序列去除，只保留原来蛋白质的天然氨基酸序列。但是有趣的是，去除掉融合蛋白序列后，这些天然序列蛋白质的水溶性常常随之下降，使人们不得不采用上述高浓度尿素或者亚硝基胍等促溶性处理使之恢复可溶性。虽然融合蛋白质技术已经在许多生物学基础研究和生物
中广泛采用，然而在快速检测领域的应用目前仅限于将His-tag标记等短小标签融合在抗原蛋白质上以方便蛋白质的纯化。如果把GST和MBP等融合蛋白质技术应用于快速检测，将在创新检测原理、扩增检测信号、提高检测灵敏度等方面具有重要意义。
技术实现思路
一、专利技术介绍本专利技术针对现有抗体快速检测技术的局限性，提出了一种直接采用携带融合标签的整体重组融合蛋白质作为捕获抗原和检测抗原的抗体快速检测新技术。本专利技术的内容和原理包括1、克隆编码携带双重标签抗原蛋白质的重组融合基因。采用聚合酶链反应 (polymerasechain reaction, PCR)等重组DNA技术，在抗原蛋白质编码基因序列的5‘_端或3 ‘_端加入一个短小多肽标签(例如His-tag)的编码序列和一个较大融合基因(例如MBP或GST)的编码序列，构建双重标签抗原重组融合基因。将构建物克隆进某一表达载体 (例如大肠杆菌表达质粒PET28)。转化导入载体宿主细胞(例如大肠杆菌菌株BL21)。2、诱导表达并纯化重组双重标签抗原融合蛋白质。培养含有上述重组质粒的菌株细胞，加入诱导物，诱导表达重组抗原融合蛋白质。然后分别根据短小多肽标签和较大融合基因的特性分离纯化重组抗原融合蛋白质。以His-tag和MBP融合蛋白为例，可以首先用固相金属亲和层析柱针对HIS-tag进行第一轮纯化，然后用直链淀粉亲和层析柱针对MBP 融合蛋白部分进行第二轮纯化，从而使重组抗原蛋白质的纯度达到或超过99%。这样高纯度的抗原蛋白质将极大减少因非特异蛋白质的存在而引起的检测本底噪音。3、将重组抗原融合蛋白质用作检测抗原。根据快速检测所采用的技术路线，重组抗原融合蛋白质用作检测抗原的途本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种直接应用重组融合蛋白质进行分析物快速检测的方法，其特征在于：（１）构建融合蛋白质编码基因：将编码用于捕获和检测分析物的蛋白质编码序列、短小多肽标签和较大融合蛋白质ＤＮＡ序列用重组ＤＮＡ技术构建到一起，形成携带双重标签（短小多肽标签和较大融合蛋白质标签）的融合基因，克隆到表达载体。（２）制备融合蛋白质：根据表达载体特点，诱导表达产生重组融合蛋白质。用针对短小多肽标签和较大融合蛋白质的亲和层析材料纯化重组融合蛋白质。（３）制备检测信号试剂：用生物素标记融合蛋白质，用胶体金标记能够特异识别生物素的蛋白质，共同组成检测信号试剂；或者采用胶体金标记融合蛋白质，作为检测信号试剂。（４）制备快速检测测试条：直接用未标记的融合蛋白质在反应平面介质上点印形成检测线；用能够与检测信号试剂特异结合的试剂在同一反应平面介质上点印形成质量控制线。根据检测信号试剂的不同，点印质控线的试剂可以是用生物素标记的常用蛋白质例如ＢＳＡ，也可以是针对检测试剂的抗体。（５）组装快速检测装置：将上述检测信号试剂、快速检测测试条、吸水纸、支持平板和塑料外壳等组装产生快速检测装置。（６）检测：加入待测样本，根据检测线和质控线的反应，确定检测结果。...
【技术特征摘要】
1.一种直接应用重组融合蛋白质进行分析物快速检测的方法，其特征在于(1)构建融合蛋白质编码基因将编码用于捕获和检测分析物的蛋白质编码序列、短小多肽标签和较大融合蛋白质DNA序列用重组DNA技术构建到一起，形成携带双重标签 (短小多肽标签和较大融合蛋白质标签)的融合基因，克隆到表达载体。(2)制备融合蛋白质根据表达载体特点，诱导表达产生重组融合蛋白质。用针对短小多肽标签和较大融合蛋白质的亲和层析材料纯化重组融合蛋白质。(3)制备检测信号试剂用生物素标记融合蛋白质，用胶体金标记能够特异识别生物素的蛋白质，共同组成检测信号试剂；或者采用胶体金标记融合蛋白质，作为检测信号试剂。(4)制备快速检测测试条直接用未标记的融合蛋白质在反应平面介质上点印形成检测线；用能够与检测信号试剂特异结合的试剂在同一反应平面介质上点印形成质量控制线。根据检测信号试剂的不同，点印质控线的试剂可以是用生物素标记的常用蛋白质例如 BSA,也可以是针对检测试剂的抗体。(5)组装快速检测装置将上述检测信号试剂、快速检测测试条、吸水纸、支持平板和塑料外壳等组装产生快速检测装置。(6)检测加入待测样本，根据检测线和质控线的反应，确定检测结果。2.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，其中所说的分析物是能够与所说的融合蛋白质特异结合的测试目的分子，主要包括但不限于人体及其他动物的抗体、抗体片段、其他蛋白质、肽、寡聚核苷酸适体、其他类型生物大分子及其复合物、以及亚细胞结构等。如果所说的分析物是抗体，则所说的融合蛋白质是能够与该抗体结合的抗原蛋白质或其片段(结构域)。3.根据权利要求1和2所述的快速检测方法，其特征在于，其中所说的较大融合蛋白质是指任何与抗原基因融合并表达产生重组融合蛋白质后，能够提高原有抗原蛋白质水溶性、或提高抗原蛋白质表达量、或提高信号分子(生物素、胶体金、酶等等)标记效率的30 个氨基酸残基以上的多肽序列。较大融合蛋白质包括但不限于任何来...
【专利技术属性】
技术研发人员：戴国祯，孙东旭，
申请(专利权)人：戴国祯，孙东旭，
类型：发明
国别省市：32
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