本发明专利技术公开了一种重组蛔虫ALAg蛋白抗原检测抗蛔虫抗体间接ELISA方法，该方法以蛔虫成虫虫体或者感染性虫卵的RNA为模板，利用RT-PCR扩增出ALAg基因，构建ALAg表达载体并转化表达菌进行诱导表达，纯化重组蛋白，以纯化蛋白为包被抗原建立间接ELISA检测方法。本发明专利技术建立了稳定而特异的抗蛔虫体IgG的间接ELISA检测方法，可用于蛔虫感染的临床监测和诊断，适宜在基层和临床广泛推广。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种蛔虫的防治及检测技术，特别是重组蛔虫AUg蛋白抗原的制备及检测抗蛔虫抗体间接ELISA方法，属于生物
技术介绍
蛔虫(Ascaris lumbricoides Linnaeus，1758)也称为人似蚓蛔虫，似蚓蛔虫病呈世界性分布，已经成为公共卫生问题之一。据报道，全世界约有14. 72亿人感染似蚓蛔虫。 我国是似蚓蛔虫感染较严重的国家之一，1990年全国人体寄生虫分布调查似蚓蛔虫感染率为44. 59%，分布范围遍及全国，尤其是农村地区，对群众健康和青少年儿童的生长发育危害较大。2008年，孙凤华报道全国31个省(区、市)共检查3566 人，似蚓蛔虫平均感染率12. 72%。似蚓蛔虫感染者轻度、中度和重度分别占81. 64%、16. 64%和1. 50%，感染率自东向西明显升高，东部、中部和西部地区分别为4.86^^16.47^^18.33 ^蛔虫是世界上流行地域最广、感染人数最多的病原生物之一，是危害人民身体健康的重要疾病。每条雌虫平均每天可产卵M万个。感染期卵在人小肠内孵出幼虫，侵入肠粘膜和粘膜下层，钻入静脉或淋巴管，经肝、右心，到达肺，穿破肺泡毛细血管，进入肺泡，表现为机械性损伤、超敏反应、营养不良以及导致宿主肠道功能障碍。当大量幼虫在肺部移行时，引起似蚓蛔虫性支气管肺炎、支气管哮喘或嗜酸性粒细胞增多症。严重时幼虫还可侵入脑、肝、脾、肾、眼和甲状腺等器官，引起异位寄生。甚至有幼虫通过胎盘进入胎儿体内寄生的报道。成虫掠夺营养和破坏肠粘膜影响吸收，导致消化不良和营养吸收障碍，从而引起儿童发育障碍，还可出现荨麻疹、皮肤瘙痒、结膜炎以及中毒性脑病等症状；似蚓蛔虫可钻入开口于肠壁的各种管道(如胆管、胰腺管和阑尾)，甚至钻入肝脏，可引起胆道蛔虫症、蛔虫性肠梗阻、蛔虫性胰腺炎或阑尾炎以及肝蛔虫病，也可上窜阻塞气管支气管，造成窒息，引起尿道和生殖器官蛔虫病及其他器官组织的蛔虫卵肉芽肿。蛔虫病的诊断往往根据临床症状，对粪便采用饱和硫酸镁漂浮集卵法发现蛔虫卵然后作出可确诊，但粪便检出时间晚而且检出率低，当通过粪便检查检出虫卵时，犬弓首蛔虫幼虫已经在犬体内移行造成肝脏、肺脏等器官或者组织损伤。相对其它虫种来说，蛔虫病的免疫诊断技术研究较少，因此发展也较缓慢。因此早期快速诊断蛔虫病具有重要的意义。 近年来，由于宿主感染蛔虫后能够引起免疫反应，因此蛔虫感染的早期诊断，流行病学调查和血清学方法检测蛔虫抗体已经成为可能。但在蛔虫幼虫时期的排泄物和分泌物构成了一个糖蛋白家族，在这个家族中至少有六种蛋白具有明显的抗原性。分泌的糖蛋白在虫体表面形成一层保护膜，该膜在宿主体内定期脱落，这种定期蜕皮的行为是寄生虫试图混淆宿主免疫系统的表现，所以宿主要建立起完全保护性免疫要很长的时间。蛔虫特异性引物， 通过PCR方法对组织内弓首蛔虫幼虫ITS-2片断进行扩增可以鉴定是否有幼虫感染。但是 PCR需要一定仪器设备，不适宜在基层和临床推广
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种，用于蛔虫感染的临床监测，从而克服现有技术(粪检虫卵法)导致漏检或者检出率低的不足。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下的技术方案一种。该方法按照下列步骤进行(1)重组蛔虫AUg蛋白抗原的制备①蛔虫成虫总RNA的提取和RT从-70°C冰箱取出蛔虫成虫虫体或感染性虫卵，置于研钵中磨成粉末，然后按RNA 提取试剂盒说明提取总RNA ；以抽提的总RNA为模板，反转录为cDNA ；②ALAg基因的扩增和克隆以cDNA为模板，根据Genbank中公布的猪蛔虫抗原基因的序列，利用I^rimer Primer 5. 0软件设计引物进行扩增蛔虫的AUg基因，所述引物中，上游引物为 5，-CGCGGATCC GCCAGTTTAAGCGAGATGC-3 ‘(含 BamHI 酶切位点)；下游引物为5，-CCGGAA TTCGAGAAGCTTATGCCTCGCTT-3 ‘(含EcoR I酶切位点)；扩增产物用DNA胶回收试剂盒回收 ALAg目的片段；将AUg与pMDIS-T载体连接，然后转化感受态细胞DH5ci，涂于含有氨苄青霉素(AMP)的LB培养基上进行培养，挑取菌落进行经菌落PCR鉴定后，抽提鉴定为阳性的菌株进行提取质粒pMDIS-T-ALAg送往大连宝生物进行测序； ③Pet28a (+) -ALAg重组质粒构建及酶切鉴定将测序正确的阳性菌，提取质粒pMD18-T_ALAg，分别采用BamH I和EcoR I进行酶切pMD18-T-ALAg质粒和Pet28a (+)表达载体，纯化目的片段进行连接成Pet28a (+) -ALAg, 并转入DH5ci中，涂于含有氨苄青霉素(AMP)的LB培养基上进行培养，挑取菌落进行经过菌落PCR和酶切鉴定后，抽提鉴定为阳性的菌株进行提取质粒Pet28a (+) -ALAg送往大连宝生物公司进行测序；④重组Pet28a(+)-ALAg质粒在大肠杆菌中的诱导表达将测序正确的阳性质粒Pet28a(+)-ALAg转化BL21 (DE3)感受态细胞，加入IPTG 进行诱导表达；⑤重组ALAg蛋白的纯化按1 100比例将培养过夜的含有Pet28a(+)-ALAg的BL21 (DE3)接种到新的LB 液体培养基中，37°C快速振荡培养至细菌生长对数中期,A55tl = 1.0 ；在IPTG诱导下，进行重组AUg蛋白的大量表达，收集诱导表达菌；离心后将细菌沉淀经反复冻融和超声裂解后， 依次用含0、2、4mol/L尿素的IX结合蛋白缓冲液洗涤沉淀；随后用含8mol/L尿素的IX 结合蛋白缓冲液重悬沉淀，冰上放置lh，使包涵体蛋白完全溶解；16，000乂8离心30!^11去除不可溶物，以孔径0. 45mm的NC膜过滤收集上清液；经His结合树脂纯化，以缓冲液洗去杂蛋白，以洗脱液洗脱重组AUg蛋白；将纯化的重组蛋白于4°C分别在含4m0l/L、2m0l/L 尿素的PBS及PBS溶液中依次进行透析，将溶液进行冷冻干燥后于4°C保存；(2)以纯化后的重组蛔虫AUg蛋白做包被抗原建立间接ELISA检测方法的建立①最佳抗原包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定将重组ALAg蛋白用pH为9. 6的0. 05M的碳酸盐稀释成为25、10、5、1、0. 5、0· 1 μ g/ mL6个浓度包被酶联板100 μ L/孔，每个浓度包被1列，于37°C温浴Ih后放置于4°C过夜，取出用含0. 05% Tween-20的PBS-T洗涤3次，每次;3min，然后每孔再加牛血清白蛋白 (BSA) 100 μ L封闭液，37°C封闭30min ；然后将已知蛔虫阳性血清和蛔虫阴性血清在酶标板上从1 20、1 40,1 80、1 160和1 320倍比稀释，分别加入酶标板中，100 μ L/ 孔，37°C反应Ih后，洗涤3次，用封闭液作1 8000稀释辣根过氧化物酶标鼠抗人IgG加入酶联板，100 μ L/孔，37°C反应lh，经洗涤后加入TMB底物溶液IOOyL/孔，反应15min, 最后加入100μ L2mol/L硫酸终止反应，用酶标仪在490nm波长下测定OD值，同时用健康人血清作方阵滴定；选择已知蛔虫阳性血清与蛔虫阴性血清OD49tl的P/N比值本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种重组蛔虫ＡＬＡｇ蛋白抗原检测抗蛔虫抗体间接ＥＬＩＳＡ方法，其特征在于，按照下列步骤进行：（１）重组蛔虫ＡＬＡｇ蛋白抗原的制备①蛔虫成虫总ＲＮＡ的提取和ＲＴ从－７０℃冰箱取出蛔虫成虫虫体或感染性虫卵，置于研钵中磨成粉末，然后按ＲＮＡ提取试剂盒说明提取总ＲＮＡ，以抽提的总ＲＮＡ为模板，反转录为ｃＤＮＡ；②ＡＬＡｇ基因的扩增和克隆以ｃＤＮＡ为模板，根据Ｇｅｎｂａｎｋ中公布的猪蛔虫抗原基因的序列，利用ＰｒｉｍｅｒＰｒｉｍｅｒ ５．０软件设计引物进行扩增蛔虫的ＡＬＡｇ基因，所述引物中，上游引物为：５’－ＣＧＣＧＧＡＴＣＣ ＧＣＣＡＧＴＴＴＡＡＧＣＧＡＧＡＴＧＣ－３′（含ＢａｍＨＩ酶切位点）；下游引物为：５’－ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＴＣＧＣＴＴ－３′（含ＥｃｏＲ Ｉ酶切位点）；扩增产物用ＤＮＡ胶回收试剂盒回收ＡＬＡｇ目的片段；将ＡＬＡｇ与ｐＭＤ１８－Ｔ载体连接，然后转化感受态细胞ＤＨ５α，涂于含有氨苄青霉素的ＬＢ培养基上进行培养，挑取菌落进行经过菌落ＰＣＲ鉴定后，抽提鉴定为阳性的菌株进行提取质粒ｐＭＤ１８－Ｔ－ＡＬＡｇ进行测序；③Ｐｅｔ２８ａ（＋）－ＡＬＡｇ重组质粒构建及酶切鉴定将测序正确的阳性菌，提取质粒ｐＭＤ１８－Ｔ－ＡＬＡｇ，分别采用ＢａｍＨ Ｉ和ＥｃｏＲ Ｉ进行酶切ｐＭＤ１８－Ｔ－ＡＬＡｇ质粒和Ｐｅｔ２８ａ（＋）表达载体，纯化目的片段进行连接成Ｐｅｔ２８ａ（＋）－ＡＬＡｇ，并转入ＤＨ５α中，涂于含有氨苄青霉素的ＬＢ培养基上进行培养，挑取菌落进行经过菌落ＰＣＲ和酶切鉴定后，抽提鉴定为阳性的菌株进行提取质粒Ｐｅｔ２８ａ（＋）－ＡＬＡｇ进行测序；④重组Ｐｅｔ２８ａ（＋）－ＡＬＡｇ质粒在大肠杆菌中的诱导表达将测序正确的阳性质粒Ｐｅｔ２８ａ（＋）－ＡＬＡｇ转化ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞，加入ＩＰＴＧ进行诱导表达；⑤重组ＡＬＡｇ蛋白的纯化按１∶１００比例将培养过夜的含有Ｐｅｔ ２８ａ（＋）－ＡＬＡｇ的ＢＬ２１（ＤＥ３）接种到新的ＬＢ液体培养基中，３７℃快速振荡培养至细菌生长对数中期，Ａ５５０＝１．０；在ＩＰＴＧ诱导下，进行重组ＡＬＡｇ蛋白的大量表达，收集诱导表达菌；离心后将细菌沉淀经反复冻融和超声裂解后，依次用含０、２、４ｍｏｌ／Ｌ尿素的１×结合蛋白缓冲液洗涤沉淀；随后用含８ｍｏｌ／Ｌ尿素的１×结合蛋白缓冲液重悬沉淀，冰上放置１ｈ，使包涵体蛋白完全溶解；１６，０００×ｇ离心３０ｍｉｎ去除不可溶物，以孔径０．４５ｍｍ的ＮＣ膜过滤收集上清液；经Ｈｉｓ结合树脂纯化，以缓冲液洗去杂蛋白，以洗脱液洗脱重组ＡＬＡｇ蛋白；将纯化的重组蛋白于４℃分别在含４ｍｏｌ／Ｌ、２ｍｏｌ／Ｌ尿素的ＰＢＳ及ＰＢＳ溶液中依次进行透析，将溶液进行冷冻干燥后于４℃保存；（２）以纯化后的重组ＡＬＡｇ蛋白作为包被抗原建立间接ＥＬＩＳＡ检测方法①最佳抗原包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定将重组ＡＬＡｇ蛋白用ｐＨ为９．６的０．０５Ｍ的碳酸盐稀释成为２５、１０、５、１、０．５、０．１μｇ／ｍＬ ６个浓度包被酶联板１００μＬ／孔，每个浓度包被１列，于３７℃温浴１ｈ后放置于４℃过夜，取出用含０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０的ＰＢＳ－Ｔ洗涤３次，每次３ｍｉｎ，然后每孔再加１％牛血清白蛋白（ＢＳＡ）１００μＬ封闭液，３７℃封闭３０ｍｉｎ；然后将已知蛔虫阳性血清和蛔虫阴性血清在酶标板上从１∶２０、１∶４０、１∶８０、１∶１６０和１∶３２０倍比稀释，分别加入酶标板中，１００μＬ／孔，３７℃反应１ｈ后，洗涤３次，用封闭液作１∶８０００稀释辣根过氧化物酶标鼠抗人ＩｇＧ加入酶联板，１００μＬ／孔，３７℃反应１ｈ，经洗涤后加入ＴＭＢ底物溶液１００μＬ／孔，反应１５ｍｉｎ，最后加入１００μＬ２ｍｏｌ／Ｌ硫酸终止反应，用酶标仪在４９０ｎｍ波长下测定ＯＤ值，同时用健康人血清作方阵滴定；选择已知蛔虫阳性血清与蛔虫阴性血清ＯＤ４９０的Ｐ／Ｎ比值最大所对应的抗原、抗体稀释度作为判定标准；②鼠抗人ＩｇＧ－ＨＲＰ的最佳工作浓度的确定将鼠抗人ＩｇＧ－ＨＲＰ作１∶５００、１∶１０００、１∶２０００、１∶４０００、１∶８０００和１∶１６０００倍比稀释，通过检测已知阳性和阴性血清，来确定鼠抗人ＩｇＧ－ＨＲＰ的最佳工作浓度；③间接ＥＬＩＳＡ方法建立将重组ＡＬＡｇ蛋白以最佳包被浓度包被酶标板１００μＬ／孔，于３７℃过夜，洗涤３次，每次３ｍｉｎ，晾干；加入１００μＬ／孔封闭液，３７℃温浴１ｈ，然后将待检血清按步骤（２）的步骤①中试验结果得出的最佳稀释倍数稀释后加入酶标板１００μＬ／孔，３７℃温浴１ｈ，洗涤３次，晾干，加入步骤（２）的步骤②试验结果得出的最佳工作浓度的鼠抗人ＩｇＧ－ＨＲＰ １００μＬ／孔，３７℃温浴１ｈ，洗涤３次，每次３ｍｉｎ，晾干，加入ＴＭＢ底物１００μＬ／孔，３７℃反应１５ｍｉｎ，最后加入１０...
【技术特征摘要】
1. 一种重组蛔虫ALAg蛋白抗原检测抗蛔虫抗体间接ELISA方法，其特征在于，按照下列步骤进行(1)重组蛔虫AUg蛋白抗原的制备①蛔虫成虫总RNA的提取和RT从-70°C冰箱取出蛔虫成虫虫体或感染性虫卵，置于研钵中磨成粉末，然后按RNA提取试剂盒说明提取总RNA，以抽提的总RNA为模板，反转录为cDNA ；②AUg基因的扩增和克隆以cDNA为模板，根据Genbank中公布的猪蛔虫抗原基因的序列，利用I^rimerfrimer 5.0软件设计引物进行扩增蛔虫的ALAg基因，所述引物中，上游引物为5’ -CGCGGATCC GCCAGTTTAAGCGAGATGC-3 ‘(含 BamHI 酶切位点)；下游引物为5’-CCGGAATTCGAGAAGCTTAT GCCTCGCTT-3'(含EcoR I酶切位点)；扩增产物用DNA胶回收试剂盒回收ALAg目的片段； 将ALAg与pMDIS-T载体连接，然后转化感受态细胞DH5 α，涂于含有氨苄青霉素的LB培养基上进行培养，挑取菌落进行经过菌落PCR鉴定后，抽提鉴定为阳性的菌株进行提取质粒 pMD18-T-ALAg 进行测序；③Pet28a(+) -ALAg重组质粒构建及酶切鉴定将测序正确的阳性菌，提取质粒pMD18-T-ALAg，分别采用BamH I和EcoR I进行酶切 pMD18-T-ALAg质粒和Pet28a (+)表达载体，纯化目的片段进行连接成Pet28a (+) -ALAg,并转入DH5 α中，涂于含有氨苄青霉素的LB培养基上进行培养，挑取菌落进行经过菌落PCR 和酶切鉴定后，抽提鉴定为阳性的菌株进行提取质粒Pet28a(+)-ALAg进行测序；④重组Pet28a(+) -ALAg质粒在大肠杆菌中的诱导表达将测序正确的阳性质粒Pet28a(+)-ALAg转化BL21 (DE3)感受态细胞，加入IPTG进行诱导表达；⑤重组ALAg蛋白的纯化按1 100比例将培养过夜的含有Pet 28a⑴-ALAg的BL21 (DE3)接种到新的LB液体培养基中，37°C快速振荡培养至细菌生长对数中期,A55tl = 1.0 ；在IPTG诱导下，进行重组 AUg蛋白的大量表达，收集诱导表达菌；离心后将细菌沉淀经反复冻融和超声裂解后，依次用含0、2、4mol/L尿素的IX结合蛋白缓冲液洗涤沉淀；随后用含8mol/L尿素的IX结合蛋白缓冲液重悬沉淀，冰上放置lh，使包涵体蛋白完全溶解；16，OOOXg离心30min去除不可溶物，以孔径0. 45mm的NC膜过滤收集上清液；经His结合树脂纯化，以缓冲液洗去杂蛋白，以洗脱液洗脱重组AUg蛋白；将纯化的重组蛋白于4°C分别在含4m0l/L、2m0l/L尿素的PBS及PBS溶液中依次进行透析，将溶液进行冷冻干燥后于4°C保存；(2)以纯化后的重组ALAg蛋白作为包被抗原建立间接ELISA检测方法①最佳抗原包被浓度及血清最佳稀释...
【专利技术属性】
技术研发人员：何光志，田维毅，安传伟，王平，黄高，王文佳，俞琦，奚锦，王乾宇，
申请(专利权)人：贵阳中医学院，
类型：发明
国别省市：52
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