一株重组鸡alpha干扰素温控表达载体的构建制造技术

本发明专利技术涉及一株重组鸡alpha干扰素温控表达载体的构建。本发明专利技术选择pBV220温控表达载体用于构建重组大肠杆菌chIFN‑α‑pBV220株(保藏编号为CGMCC No.13431)，该重组菌株通过调节培养温度成功诱导表达具有生物活性的chIFN‑α蛋白。该重组菌株的构建使其表达的产品不仅能够提高大规模工业生产的效益也为鸡病毒性疾病的治疗和预防提供新药物的目的成为现实。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一株重组鸡alpha干扰素温控表达载体的构建。属于兽用生物制品领域。
技术介绍
鸡的病毒性疾病是危害养鸡业最为严重的疾病之一。目前，我国预防和控制鸡病毒性疾病主要依靠疫苗免疫，由于疫苗免疫的血清型单一，而病毒毒株变异速度快，从而常导致疫苗免疫失败。鸡alpha干扰素(chIFN-α)作为一种多功能细胞因子，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生理功能，其不仅对鸡的病毒性疾病如新城疫、传染性法氏囊炎、传染性喉气管炎和传染性支气管炎等具有良好的治疗效果，而且能够显著提高疫苗的免疫效力。此外，干扰素相比于抗生素具有无毒副作用、无药物残留和不产生耐药性等优点，因此chIFN-α产品的研发对鸡病毒性疾病的预防和治疗具有重要的临床意义。目前chIFN-α产品的研发方法主要包括诱生剂诱导免疫细胞提取干扰素蛋白法和基因工程技术表达干扰素蛋白两种方法。诱生剂诱导免疫细胞提取干扰素蛋白法生产的干扰素产品面临两个问题：一是大量生产必须保证有足够数量的外周血白细胞，二是以病毒作为诱生剂存在潜在病毒污染的情况。此外，这种方法提取的干扰素产量有限、产物成分复杂、价格昂贵，从而限制了其在临床上的应用。以基因工程技术为依托生产的基因重组鸡干扰素产品因产物成分单一、操作简单、产量高和适应于大规模生产等特点而得到了广泛的应用。基因重组chIFN-α的表达系统根据表达宿主的不同分为原核表达系统、酵母表达系统、哺乳细胞表达系统和昆虫表达系统。其中原核表达系统相比于其他的表达系统具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化效率高、生长繁殖快、成本低廉等优点成为重组基因工程chIFN-α大规模工业生产的优选表达系统。而大肠杆菌因具有操作简单和能在廉价的培养基中迅速生长的特征，成为原核表达系统首选的表达菌株。常用于基因重组蛋白表达的大肠杆菌菌株包括DH5α、BL21和JM系列；常用的大肠杆菌表达载体有pBV220、pBV321、pET28a和pET32a等。其中pBV220表达载体属于温度敏感系统表达载体，该载体的启动子为PL和PR强启动子，该启动子受λ噬菌体CI基因负调控，当温度达到42℃时宿主菌表达目的蛋白。pET28a和pET32a表达载体的启动子为lac强启动子，该启动子受大肠杆菌lac阻遏蛋白负调控，需要在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达目的蛋白。与IPTG诱导宿主菌表达目的蛋白不同，温控表达载体只需要调节温度即可实现目的蛋白的大量表达，因此其大大节省了大规模工业生产的成本。
技术实现思路
本专利技术的目的是基于基因重组chIFN-α蛋白研发的重要临床意义和社会价值，选择pBV220载体为表达载体，以DH5α大肠杆菌为宿主菌构建chIFN-α-pBV220重组菌株并在42℃条件下诱导该菌株表达chIFN-α蛋白。本专利技术技术方案1.一株重组鸡alpha干扰素温控表达载体，其特征在于该重组温控表达载体为chIFNα-pBV220重组温控表达载体，该重组温控表达载体中连接有重组chIFN-α基因(序列1)，并转入DH5α大肠杆菌，该株菌被命名为重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株，简称重组大肠杆菌chIFN-α株，保藏编号为CGMCCNo.13431。2.本专利技术所述一株重组鸡alpha干扰素温控表达载体的构建，其特征在于该载体的构建是：(1)以SPF鸡外周血淋巴细胞cDNA为模板扩增出chIFN-α目的基因片段；(2)回收并纯化目的基因片段经测序，测序结果确认表明该PCR产物为chIFN-α目的基因；(3)将经双酶切的pBV220温控表达载体与步骤(2)中的目的基因片段连接获得重组chIFNα-pBV220载体；(4)将重组chIFNα-pBV220温控表达载体转入DH5α大肠杆菌后涂布含氨苄抗生素的琼脂平板，37℃培养过夜后挑取阳性克隆子经测序确认，获得构建重组chIFNα-pBV220温控表达载体，并转入DH5α大肠杆菌，该株菌被命名为重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株，简称重组大肠杆菌chIFN-α株，并已于2016年12月07日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13431。本专利技术具体实施方式1.根据NCBI核酸数据库中搜索编码chIFN-α蛋白的581bp核苷酸序列(GenBank:AM049251.1)在此基础上本专利技术人设计：在基因序列1的3’端终止密码子前添加组氨酸(His)标签以便于蛋白纯化，同时在目的片段两侧添加EcoRI和SalI限制性内切酶位点用于获得线性化pBV220表达载体，然后通过PrimerPremier5分析软件分别设计反转录PCR中的特异性引物(序列1和2)和目的基因的上下游引物(序列3和4)，见表1。表1反转录PCR引物序列和目的基因片段引物序列2.以SPF鸡外周血淋巴细胞全RNA为目的基因片段模板。经对提取的鸡外周血淋巴细胞全基因组RNA用序列1和序列2进行反转录反应，并以序列3和序列4的上下游引物扩增出chIFN-α目的基因片段，结果见图2；回收并纯化目的基因片段送去测序，测序结果表明该PCR产物为chIFN-α目的基因，其序列为序列5。3.双酶切pBV220温控表达载体(该载体属于温度敏感系统表达载体，pBV220质粒购自优宝生物)并将其与目的基因片段连接，连接产物热转化DH5α大肠杆菌后涂布含氨苄抗生素的琼脂平板，37℃培养过夜后挑取阳性克隆子送去测序。测序结果显示重组多克隆载体上目的基因片段核苷酸序列与NCBI上chIFN-α基因的核苷酸序列的匹配度为96％，表明本研究成功构建重组chIFNα-pBV220温控表达载体，并转化DH5α大肠杆菌。该株菌被命名为重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株(简称重组大肠杆菌chIFN-α株)，并已于2016年12月07日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13431。4.通过调节温度实现目的蛋白的诱导表达，即将重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株菌迅速升温至42℃条件下诱导5h，实现目的蛋白的诱导表达；最后以细胞病变抑制法检测重组chIFN-α蛋白的生物学活性。细胞病变抑制试验表明该菌株诱导表达的chIFN-α蛋白能够有效抑制水泡性口炎病毒(VSV病毒，2013年3月购自北京北纳创联生物技术公司)在人羊毛膜细胞(Wish细胞，2013年3月购自上海极威生物科技有限公司)上增殖，说明其具有良好的生物活性。根据Reed-Muench法计算该菌株诱导的chIFN-α蛋白生物学效价为2～5×105IU/ml。附图说明图1chIFN-α目的基因PCR扩增产物经1.2％DNA琼脂糖凝胶检测结果图中Marker为DL2000DNAmarker。图2重组chIFN-α蛋白诱导表达结果图中M为BluePlusProteinMarker(14-100KD)；1为pBV220空载体诱导表达样品；2为chIFN-α诱导表达蛋白样品；3为chIFN-α未诱导表达蛋白样品。本专利技术涉及的生物材料资源信息本专利技术人应用生物技术构建的pBV220温控表达载体构建的重组大肠杆本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株重组鸡alpha干扰素温控表达载体，其特征在于该重组温控表达载体为chIFNα‑pBV220重组温控表达载体，该重组温控表达载体中连接有重组chIFN‑α基因(序列1)，并转入DH5α大肠杆菌，该株菌被命名为重组大肠杆菌chIFN‑α‑pBV220株，简称重组大肠杆菌chIFN‑α株，保藏编号为CGMCC No.13431。

【技术特征摘要】
1.一株重组鸡alpha干扰素温控表达载体，其特征在于该重组温控表达载体为chIFNα-pBV220重组温控表达载体，该重组温控表达载体中连接有重组chIFN-α基因(序列1)，并转入DH5α大肠杆菌，该株菌被命名为重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株，简称重组大肠杆菌chIFN-α株，保藏编号为CGMCCNo.13431。2.如权利要求1所述一株重组鸡alpha干扰素温控表达载体的构建，其特征在于该载体的构建是：(1)以SPF鸡外周血淋巴细胞提取的全RNA为模板，并以RT-PCR的方法扩增出chIFN-α目的基因片段；(2)回收并纯化目的基因片段经测序，测序结果确认表明该PCR产物为chIF...

【专利技术属性】
技术研发人员：江国托，李凤华，潘珊，徐凤平，
申请(专利权)人：大连三仪动物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21