【技术实现步骤摘要】
各种干扰素都是用较高级的动物细胞经过病毒和核酸等的诱发而产生的蛋白质，具有抗病毒和抗癌等作用。目前，按特性的差异，一般将干扰素分成α、β和γ三种类型。有关α型和β型干扰素的各种研究工作已经取得了相当大的进展。经过改进的纯化干扰素的方法已经出现。对于干扰素性质，也已有了相当深的认识。在能使淋巴细胞冲击转型或产生淋巴激活素那样的条件下，能用免疫活性细胞制造γ型干扰素。因此γ型干扰素也称为免疫干扰素。与α型和β型干扰素相比，γ型干扰素具有较高的抗增生或抗癌活性，因此从临床应用的观点来看，其优越性更大。但是由于受到如制造γ-干扰素需要新鲜淋巴细胞之类的各种限制，有效的生产系统至今未建立起来。曾有人指出，用不同的实验系统和不同品种的细胞生产γ-干扰素时，能生产出不同分子的，结构和性质等至今还不清楚的γ-干扰素品种。本专利技术者曾从是旨在开发一种纯化由基因工程技术制造的人体γ-干扰素的工艺方面的研究和发展工作。在有关的研究工作中，他们发现γ-干扰素具有强的聚合倾向。其结果是使单节显性人体γ-干扰素的产率大大降低。虽然述及人体γ-干扰素的物理和化学性质的文献很少，但是它可能具有聚合型是清楚的。不过如何从聚合型转化成单节显性型，或者如何阻止由单节显性型转化成聚合型，则是前所未知的。本专利技术为制造单节显性人体γ-干扰素提供了一种方法。这种方法包括在还原硫化物和蛋白质变性剂存在下使粗人体γ-干扰素经受凝胶过滤。上文提到的用本专利技术方法纯化的人体γ-干扰素，可以是任何含人体γ-干扰素的原料，例如，可以用自然界存在的人体γ-干扰素(即天然γ-干扰素)经过浓缩后所得的粗产物，或用...
【技术保护点】
在还原硫化物和蛋白质变性剂存在下，粗人体γ－干扰素经过凝胶过滤制造单节显性人体γ－干扰素的方法。
【技术特征摘要】
的说文中mM和M分别表示毫克分子浓度和克分子浓度。图的简要说明图1表示多肽(Ⅰ)氨基酸的排列顺序，重组γ-干扰素的例子。图2表示参考例2-(Ⅰ)中质粒PHIThp 1101-d2的构成图。下列诸例和参考例更详细地阐述了本发明，但决无限制本发明应用范围的意思。诸例中述及的抗体柱Ab(Mor-2-11.1)系根据欧洲专利0103898(国际申请号PCT/JP83/00174，存档日期1983年5月31日)。例1(Ⅰ)将300毫升含7M盐酸胍和2mM苯甲磺酰氟的100mM三盐酸缓冲液(PH7.0)，加入100克的由参考例1制得的冷冻细胞中，在4℃下将此混合物搅拌1小时，然后离心分离(17000转/分，30分钟)。用由137mM氯化钠，2.7mM氯化钾，8mM磷酸氢二钠和1.47mM磷酸二氢钾组成的缓冲液(以下简写为PBS)将所得清洁透明的上清液稀释到70倍。用沙氏离心机(10，000转/分)除去所产生的沉淀，然后用Pericon膜滤器(Millipoke公司产，可以通过分子量低于1000的物质)将所得的22立升上清液浓缩到1.5立升。证此浓缩液在4℃下静止一夜，然后再进行离心分离(10000转/分，30分钟)，以除去所产生的沉淀以1000毫升/时的流率，将所得的上清液输入予先填充好的抗体柱〔Ab(Mor2-11.1)，5×3厘米〕。然后将500毫克的PBS，1000毫升含1M氯化钠和0.1%吐温20的10mM磷酸盐缓冲液(PH7.0)，500毫升的PBS和500毫升含0.5M盐酸胍的20mM磷酸缓冲液(PH7.0)等洗涤用溶液依次通过抗体柱。然后用含2M盐酸胍的20mM磷酸盐缓冲液(PH7.0)进行洗脱，以取得62毫升具有抗病毒活性的洗脱物。(Ⅱ)用含1mM乙二胺四乙脂酸，150mM氯化钠，10mM盐酸半胱氨酸和2M盐酸胍的25mM乙酸盐缓冲液，对装填了丙烯酰基凝胶S-200(Pharmacia公司销售)的柱子(50×60.0厘米)进行予平衡。将例1-(Ⅰ)中所得的62毫升含γ-干扰素的洗脱物输入该柱内，然后同一缓冲液洗脱，以取得83毫升的单体洗脱物。该洗脱物的硫酸十二烷酯切片电泳法(以下用SDS-PAGE表示)测定结果也证明其单节显性型的聚集(表观分子量约为18000)。经过这种分子筛处理，得到3.7毫克比活性为1.5×107单位/毫克蛋白质的γ-干扰素。在参照试验中，除了凝胶过滤用的展开溶剂不含10mM的盐酸半胱氨酸外，其余均用与例1-(Ⅱ)相同的方法对用例1-(Ⅰ)方法制的γ-干扰素进行处理，结果是洗脱物中二聚物和低聚物约占90%，单聚物只约占10%。此结果证明，盐酸半胱氨酸和盐酸胍同时存在的作用是使单节显性型聚集。(Ⅲ)用含10mM盐酸半胱氨酸、150mM氯化钠和0.01%吐温20的25mM乙酸盐缓冲液(PH6.0)，对葡聚糖G25柱(5.0×60.0厘米)进平予平衡。将例1-(Ⅱ)获得的83毫升含γ-干扰素的洗脱物输入该柱，然后用相同的缓冲液洗脱。这样得到的含γ-干扰素的洗脱物(90毫升，2.7毫克)不含盐酸胍，比活性为1.7×107单位/毫克蛋白质。(Ⅳ)将450毫克的人体血清清蛋白加入90毫升例1-(Ⅲ)获得的含γ-干扰素的洗脱物中，稀释之后用超滤法将溶液浓缩到60毫升，超滤用的膜是Diaflo PM-10膜(Amico超滤膜)。将此浓缩物输入予先用含150mM氯化钠的25mM磷酸盐缓冲剂(PH7.0)平衡过的葡聚糖G75柱(5×60厘米)，然后用同一缓冲剂展开和洗脱，以取得含γ-干扰素的洗脱物，这种方法清除了例1-(Ⅲ)获得的含γ-干扰素的洗脱物中残存的半胱氨酸，得到了33毫升(2.2毫克)、含血清清蛋白和具有比活性为1.5×107单位/毫克蛋白质的γ-干扰素溶液。例2按得到浓度为10mM溶液的要求，将谷胱甘肽(还原型)加入用与例1-(Ⅰ)相同的方法所得到的抗体柱洗脱物中，以取得富单聚物、比活性为3×106单位/毫克蛋白质的粗γ-干扰素溶液(63毫升、11毫克)。然后用与例1-(Ⅱ)相同的方法(除凝胶过滤缓冲液中的半胱氨酸为10mM的还原型谷胱甘肽所代之外)，处理该粗γ-干扰素溶液。此法所聚集的单体洗脱物(85毫升)，同样可以用SDS-PAGE方法证明其单体型的聚集(表观分子量约为18000)。将425毫克的血清清蛋白加入85毫升的洗脱物，然后进行凝胶过滤，以制取90毫升不含盐酸胍和比活性为1.8×107单位/毫克蛋白质的γ-干扰素的溶液。例3(Ⅰ)取参照例2-(Ⅱ)制得的冷冻细胞5.9毫克悬浮于18毫升含7M盐酸胍和2mM苯基甲基磺酰氟的0.1M三盐酸缓冲液(PH7.0)中。在4℃下将此混合搅拌1小时，然后离心分离(10000转/分，30分钟)。用260毫升含137mM氯化钠，2.7mM氯化钾，8.1mM磷酸氢二钠和1.5mM磷酸二氢钾的缓冲液(PH7.4)(以下简写为PBS)稀释所产的20毫升上清液，然后以1毫升/分的流率将稀释液通过单克萨抗体(Mor2-11.1)柱(床体积12毫升)。用60毫升含0.5M盐酸胍的20mM磷酸钠缓冲液(PH7.0)洗涤抗体柱，然后用36毫升含2M盐酸胍的20mM磷酸钠缓冲液洗脱多肽，以取得20毫升具有抗病毒活性的洗脱物。将此20毫升的洗脱物送入用含2M盐酸胍，0.15M氯化钠，1mM乙二胺四乙酸酯和10mM半胱氨酸的25mM乙酸铵缓冲液(PH6.0)平衡过的丙烯酰基凝胶S-200(Pharmacia精细化学公司产)柱(2.6×94厘米，床体积500毫升)，然后用相同的缓冲洗脱，以制得37毫升具有抗病毒活性洗脱液。这样可以获得5.9毫克比活性为1.0×107单位/毫克的肽。十二烷磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析法(根据Laemmli提出的方法〔Nature 227，680-685(1970)〕)测定的结果表明，多肽的分子量约为18000。在非还原的条件下，在相当于二聚物分子位置上只观察到了若隐若现的蛋白质带。参考例1如欧洲专利0089676例8中所述的，在30℃的MP葡萄糖培养基中培养载有人体γ-干扰素基因表现的菌株RRI(PRK...
【专利技术属性】
技术研发人员：奈良洁，本多进，
申请(专利权)人：武田药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]
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