人促红细胞生成素互补DNA的克隆制造技术

本发明专利技术涉及制造能与人促红细胞生成素单克隆抗体起免疫学反应的肽的方法，还涉及制造及其编码的ＤＮＡ片段，含有这个片段的重组ＤＮＡ分子，包含携带此ＤＮＡ分子的表达载体及以此转化的微生物的方法．本发明专利技术也涉及这一系列方法得到的产品．（*该技术在2005年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及人促红细胞生成素(EP)互补脱氧核糖核酸(CDNA)的克隆，克隆的制备及其表达产物。本专利技术特别涉及到(1)从人肾脏信息核糖核酸(MRNA)构建的互补DNA文库中 定出人EP CDNA克隆。(2)人EP CDNA的合成及在PBR322质粒中的插入。(3)上述CDNA表达菌E6COLI(大肠杆菌)的增殖。(4)上述CDNA表达的产物。我的题为“逆向免疫亲和层析纯化法”的共同未决申请已经在第 号专利申请中充分公开，并与本申请同时递交。在此提及该申请作为详述。(此后该申请被称为“EP纯化专利申请”。我的题为“人尿中促红细胞生成素单克隆抗体和分泌上述抗体的杂交瘤”的共同未决申请已在第 号专利申请中充分公开，并与本申请同时递交，在此提及该申请作为详述。(此后该申请被称为“抗EP专利申请”。长期以来要求可靠地充裕地供应人的EP以有助于更好地了解促红细胞生成素的分子机制，并且贡献于(1)发展诊断和治疗贫血的方法。(2)了解哺乳动物细胞的分化和发展。不能提供足够的人EP是由于原料的稀少、纯化的困难和对EP生源说缺乏精确的认识。本专利技术在用直接逆向亲和层析法纯化天然的EP(在EP纯化专利申请中说明)和制备抗EP的单克隆上取得的进展(在抗EP专利申请中说明)，使有可能尝试克隆人的EP基因，克隆的基因表达后，可产生EP蛋白质。本专利技术的目的是提供人EP蛋白质的另一个来源。另一个目的是 定人EP信息核糖核酸(MRNA)。再一个目的是合成并确定人EP CDNA的特性。还有一个目的是产生表达人EP CDNA的重组生物体。进一步的目的是纯化所述EP CDNA表达产物。再进一步的目的是确定人EP CDNA的顺序，并 定人EP的组成。本专利技术的描述以及附的几项说明及附图是一目了然的。一方面本专利技术涉及到与抗人促红细胞生成素(EP)的单克隆抗体有免疫化学反应的一个肽。另一方面本专利技术涉及到编码上述肽的DNA片段。再一方面本专利技术还涉及到已在哪一点上插入了一个DNA片段的DNA分子，此DNA片段包括了编码所述肽的DNA顺序在内。还有一点，本专利技术涉及到含有所述DNA分子的转化的活生物体，所述生物体有表达所述肽的能力。最后，本专利技术涉及到产生上述肽、DNA片段、DNA分子和生物体的方法。图1为人肾多聚腺嘌呤核苷酸信息核糖核酸(POLY(A)+MRNA)体外翻译产物和翻译产物与抗EP单克隆抗体免疫沉淀的电泳萤光图。图2A十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PACE)分离的自人肾提取物总蛋白质制备的EP粗制品与纯化的EP银染色描绘图。图2B在所 定的样品中，表明有免疫学法测出的EP特异性蛋白质的免疫吸印放射自显影图。图3琼脂糖凝胶电泳按分子大小分段分离的MRNA的体外翻译产物电泳放射显影图。图4A用菌落杂交法检出载有阳性菌落的硝酸纤维膜放射自显影图。图4B载有阳性菌落，PEP2滤膜的同类型放射自显影图，PEP2在大肠杆菌中以B一乳胺酶融合蛋白形式表达，用单克隆抗EP抗体原位放射免疫测定法检测出。图5阳性EP克隆插入的CDNA琼脂糖腺胶电泳，溴乙锭染色，紫外光透照法显示。图6A与阳性EP克隆杂交选出的MRNA体外翻译产物电泳萤光图。图6B用阳性EP克隆杂交选出的MRNA体外翻译产物电泳抗EP免疫吸印图。图7在未标记的EP存在与不存在时杂交法选出的分子量为29000与15000道尔顿翻译产物的竞争性免疫沉淀自显影图。为了克隆EP CDNA，第一次分离了它的功能MRNA。在MRNA的分离工作中遇到了困难，因为对EP合成的特异性细胞位点还没有肯定的了解，虽然已知肾脏起了关键作用。另一困难是活的人肾样品缺乏及EP含量低。因此需要寻找高EP水平和大量的可供应的组织来源。据文献报导，红细胞增多症可能与各种肾脏肿瘤有关，一些肾癌病人瘤提取物表明EP水平增高，这样的肿瘤常被认为是EP产生癌，无论如何，肾癌肿瘤仅有极少数伴有明显的EP水平增高，因此，肾癌组织在体外培养以后产生EP的能力不再有保证了。从而本专利技术者广泛地寻找高EP水平的人肾肿瘤，努力鉴定并保证功能MRNA不间断的供应。导致本专利技术的工作中，总计检查了36个肾细胞癌，其中两侧用人工缺氧致红细胞增多症的小鼠生物测定法证明有很高的EP水平(0.9和0.3单位/克组织)。观察到肾脏癌中正常组织及癌组织的培养物，某些时候表现有EP滴度升高，相反的、正常肾组织的培养物，用同样方法未检测出EP活性。在本专利技术之前，没有特异的方法可分离人肾MRNA，肾组织中含使MRNA失活的核糖核酸酶(Rnase)很高，并很难制成匀浆。进一步的困难由于肾切除样品供应有限，从而通常用于分步分离组织样品的方法(分成胞浆、微粒体、核部分)不能用。因此所有细胞核酸首先从裂解的肾细胞提取物中分离，MRNA按下法选择性集中。自肾癌受染组织的EP阳性样品得到的正常及癌组织部分，用于制备MRNA，全部过程中必须注意减少核酸酶(内源或外源的)的降解作用。因此，首先在提取缓冲液中加入核酸酶抑制剂。在接触核酸样品之前，试剂应灭菌，玻璃皿应在250℃烘烤过夜。氧钒基一核糖核苷(VRNS)复合物或核酸酶抑制剂(RNASIN)为常选用的核酸酶(RNASE)外源性抑制剂。最首选的抑制剂为VRNS。提取缓冲液中也包括促溶剂(如乙烯、乙二醇、丙烯乙二醇或其它常用乙二醇)、解离剂(如肌氨酸衍生物、盐酸胍或异硫氰酸胍)、还原剂(如B-基乙醇)等的联合应用。总的说，所用方法及试剂极大地影响MRNA的产量和功能。最首选的提取缓冲液中含有异硫氰酸胍、肌氨酸衍生物、β-基乙醇、枸椽酸钠和氧钒基一核糖核苷复合物，以上试剂起分解细胞结构、解离蛋白质和钝化降解酶及核酸酶的作用。本专利技术应用的MRNA分离方法，快速、方便、产量好。开始，细胞的裂解非常重要。首先在液氮中干捣碎组织(如用通常的打碎器一样)，以保证足够的温度。这时所有的酶均无活性。粉状组织用提取缓冲液处理，最方便、充分的是在粉末打碎器中完成。融化细胞物质，再进一步打碎以切剪DNA，并将样品通过一个针头，切剪的程度由混合物的粘稠度明显下降来证明。采用ULVICH等常用方法(见大鼠胰岛素基因含有编码顺序的质粒的构建。科学(SCIENCE)196期1313页(1977年)。并有特殊改进，见例2。总RNA浓度用260毫微米(NM)处光的吸收度测定〔吸收率260/230、260/280接近于2〕。这表明没有蛋白质及多糖的污染，产量约0.5-1毫克RNA/克组织。多聚腺嘌呤核糖核酸(POLY(A)+RNA)用寡聚胸腺嘧啶核苷酸一纤维素(OLIGO DT-CELLULOSE)柱层析选出，按阿维夫(AVIV，H·)等人的方法，(见用OLIGO DT-纤维素柱析法纯化具有生物活性的珠蛋白MRNA)。刊在美国国家科学院学报(PROC·NAT·ACAD·SCI(USA))69期1408-1412页(1972年)。选出的POLY(A)+RNA在低温贮存于乙醇中，在这样条件下可以保证RNA的稳定度。为证明POLY(A)+RNA含有EP信息(有功能性EP M RNA)，取一些OLIGO DT-纤维素选出的MRNA做体外翻译，用麦胚无细胞系统或首选MRNA依赖的兔网织细胞裂解系统进行翻译，按佩勒姆(PELHA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽，其特征是与人促红细胞生成素单克隆抗体起免疫学反应。

【技术特征摘要】
1.一种多肽，其特征是与人促红细胞生成素单克隆抗体起免疫学反应。2.根据权利要求1所述的多肽，其特征是它由一个至少包含有为所述肽编码的DNA序列在内的一个DNA片段的生物体产生的。3.根据权利要求2所述的多肽，其特征是产生它的生物体被包含所述DNA的表达载体转化。4.一种融合蛋白质，其特征是本质上它由能与抗人促红细胞生成素单克隆抗体起免疫学反应的肽及生物体内源性蛋白质的一部分所组成。5.一种DNA片段，其特征是含有给能与抗人促红细胞生成素单克隆抗体起免疫学反应的肽编码的脱氧核糖核苷酸序列。6.一种重组DNA分子，其特征是包含权利要求5所述的DNA片段。7.一种生物体，其特征是它被权利要求6所述的DNA分子转化。8.根据权利要求8所述的生物体，其特征是它含有一个大肠杆菌种的细菌。9.根据权利要求6所述的重组DNA分子，其特征是在含有为上述肽编码的所...

【专利技术属性】
技术研发人员：西尔维亚，
申请(专利权)人：纽约大学，
类型：发明
国别省市：US[美国]