载体制造技术

一种新载体，其中至少含有一个启动子区，该启动子区存在于两个不同的限制性内切酶切点之间，这两个位点能产生相同的粘性末端．该载体可以作为多重启动子的基本形式．用此载体制造多重启动子，就使由遗传工程合成更有效的蛋白质成为可能．／／（Ｃ１２Ｎ９／１６Ｃ１２Ｒ１：４２５）（Ｃ１２Ｎ１５／００Ｃ１２Ｒ１：４２５）（*该技术在2005年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新颖载体。更为特殊的是，专利技术所涉及的这种载体，其特征是至少含有一个启动基因区，此启动基因区出现在两个限制性内切酶断裂位置之间，而这两个位置分别地为两种不同的限制性内切酶所识别，但在断裂处却给出了两个相同的粘性末端。这种启动基因是一种调节因子，它控制着由RNA所提供的遗传信息。其作用相当于是一个被RNA聚合酶所识别的位置，相当于是一个RNA聚合酶联接的位置，和相当于RNA合成的起始点，在蛋白质的合成中起非常重要的作用。Lac启动基因、trp启动基因和β-内酰胺酶启动基因是人们所熟知的启动基因，它们在宿主大肠杆菌(Escherichiacoli)中的表型表达具有显著的功效。在探索一种更有效的启动基因的研究中，一直在寻找这样的启动子并创造了杂种启动基因。例如，tac启动基因是由trp启动基因和Lac启动基因所组成。这是人们所熟知的杂种启动基因。对于以酵母为宿主的启动基因来说，被提到的有PGK启动基因、ADH启动基因和phoE启动基因。在探寻一种更有效的启动基因中，本专利技术人将研究引导到那些各包括有众多的系列启动基因的各种启动基因中去。研究结果，他们发现，提供了这样一种载体，即其上有一个启动区，该区在两种限制性内切酶分别识别的切点之间，而又在两个切点上分别形成相同的粘性末端，那么，就能造出一系列的含有众多启动子的载体。目前，本专利技术已经完成了。所以，本专利技术所涉及的是这样的载体，其特征是在两个限制性内切酶断裂位置之间至少出现一个启动基因区，而这两个位置分别地为两种不同的限制性内切酶所识别，而在断裂处却给出两个相同的粘性末端。在附图中，图1表示了pDR540和由此衍生得到的pTL1，后者对于多重tac启动基因来说是一种基本质粒;图2表示了从pTL1构成多重tac启动基因的示意图;图3表示了多重tac启动基因的构成示意图;图4指出了pYN1的限制性内切酶断裂位置;图5表示了pYN1的trp启动基因/操纵基因区的，以及围绕它们的DNA序列;图6指出了pYN3的trp启动基因/操纵基因区内部和周围的限制性内切酶断裂位置;图7指出了pYN4的限制性内切酶断裂位置;图8指出了pYN6的限制性内切酶断裂位置;图9表示了在pYN6的trp启动基因/操纵基因区中的DNA序列;图10指出了pYN8、pYN9和pYN10的限制性内切酶断裂位置;图11表示了pYN20的制备示意图，pYN20通过SalⅠ和XhoⅠ位置用以制备多重trp启动基因;图12指出了从pYN20制备pYN21的示意图，pYN21起着多重trp启动基因的基本构成的作用;图13指出了利用SalⅠ和XhoⅠ位置制备双重和三重trp启动基因的示意图。按本专利技术所述，“具有相同的粘性末端”意味着在限制性内切酶断裂处出现单股断裂的那些部分具有相同的碱基序列。例如，BglⅡ判别序列是5′-AGATCT-3′3′-TCTAGA-5′在断裂处，5′-GATC-3′成为粘性末端。另一方面，BamHⅠ识别序列是5′-GGATCC-3′3′-CCTAGG-5′在断裂处，5′-GATC-3′成为粘性末端。其他限制性内切酶结合位置是SalⅠ与XhoⅠ和BamHⅠ与BclⅠ，这些结合位置也给出相同的粘性末端。上述事实使两端可能发生连接(以下称为“连接”-Ligation)。此连接位置不可能再被前边所用的两种酶所断裂，这是因为这两个酶的识别位置之间有差别。利用这一特性，就可能制备多重启动基因。例如，BamHⅠ和BglⅡ粘性末端彼此连接时，就得到下面的序列。5′-GGATCT-3′3′-CCTAGA-5′这样，在这一MboⅠ断裂位置上不再能够用BamHⅠ或BglⅡ断裂了。SalⅠ和XhoⅠ粘性末端彼此连接时，就得到下面的序列。5′-GTCGAG-3′3′-CAGCTC-5′这一序列是TaqⅠ断裂位置，所以不再能够被SalⅠ或XhoⅠ断裂了。根据本专利技术，一个操纵基因和一个SD序列可以与两个不同的限制性内切酶的识别位置之间的启动基因一起存在。操纵基因区控制着mRNA的合成，通过与一特定的阻遏物相互作用，使之与邻近的结构基因相符合。SD序列是一个核糖体连接位置，被置于蛋白质合成起始位置的邻接位置和上方。根据专利技术所提供的载体能够起到多重启动基因的一个基本形式的作用。通过利用所谓的载体来构成多重启动基因，希望以基因工程来更有效地合成蛋白质成为可能。〔多重启动基因的合成〕这里所出现的术语“多重的启动基因”，意思就是众多的重复出现的相邻的启动基因。这里，它可以包括一个操纵基因和一个SD序列。当所述的操纵基因和SD序列未被包括在启动基因中时，操纵基因和SD序列应存在于多重启动基因的邻接位置和下方。按照上述方式连接许多启动基因，可导致提高mRNA的转录效率。trp启动基因是一种能够有效地产生多肽的启动基因。当它变为多重时，能够给出一种可大大提高产率的启动基因。曾经提到过具有以下序列的启动基因作为一种trp启动基因。 此启动基因用pDR720(可从PLBiochemica1得到)和pGX112(可从Genex得到)制备。虽然pDR720没有SD序列，但那些表现遗传信息所必不可少的基本单元-35区段、-10区段，和SD序列可以用pGX112衍生一个复合物来获得。所述的启动基因的大小约为70bp，并且能够容易地被切开以用于外来基因的表现。杂化启动基因可以高产率地和高可调节地诱导生产所需要的多肽。例如，可能有一种提到过的tac启动基因，它是一种介于trp启动基因和lac启动基因之间的杂种，并且是介于rrn启动基因和lac启动基因之间的杂种启动基因。tac启动基因包括了trp启动基因衍生物-35区段(RNA聚合酶识别位置)和lac启动基因衍生的-10区段(RNA聚合酶连接位置，Prinbnow box)，并且使多肽的生产具有高产率。tac启动基因也含有lac启动基因衍生的操纵基因和SD序列，受乳糖阻遏物所控制，并且其优点在于可很方便地进行调节。使这种tac启动基因多重化后，就能够得到一种能够提供很高的多肽产率的，有很高的可调节性的启动基因。这样的多重tac启动基因可以从pDR540(可从PL Biochemical得到)衍生一个基本载体pTL1来制取。将结构基因插入到这样获得的载体上的启动基因/操纵基因(以下缩写为P/O)下方的限制性内切酶位置处，并且用插入产物来使宿主发生转化，从而所述的基因的表现变为可能了。优先选用的宿主是大肠杆菌(Escherichia coli)。有关本专利技术的载体的例子在下面给以叙述。DNA的酶解和连接进行如下混合所需要的DNA(或几种INA)和酶(或几种酶)，并用与反应相适应的缓冲液(酶解反应或连接反应)，以制备50～100微升的反应混合物，反应混合物中DNA的最终浓度约为1微克/微升，使反应进行2小时至过夜。酶的用量是每微克DNA用大约3个单位。反应温度，当使用T4连接酶时为12～16℃，BclⅠ酶解反应是50℃，SmaⅠ酶解反应是30℃，TaqⅠ酶解反应是65℃，用其它酶反应是37℃。下面是反应缓冲液组成，各自的浓度均10倍于进行反应所需要的在实际使用这些缓冲液时，将它们加于反应体系，在数量上作了10倍的稀释。10×EcoRⅠ 缓冲液 1.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种载体，其特征在于，至少有一个启动基因区，该区位于两个限制性内切酶的切点之间，这两个位点是被两种不同的限制性内切酶分别识别，但给出相同的粘性末端。

【技术特征摘要】
1.一种载体，其特征在于，至少有一个启动基因区，该区位于两个限制性内切酶的切点之间，这两个位点是被两种不同的限制性内切酶分别识别，但给出相同的粘性末端。2.一种根据权项1所述的载体，其特征在于，所述的两种不同的限制性内切酶是Bgl Ⅱ和Bam HⅠ。3.根据权项1或2所述的载体，其特征在于，在Bgl Ⅱ和Bam HⅠ切点上方出现一个Eco RⅠ切点。4.根据权项1所述的载体，其特征在于，所述的两种不同的限制性内切酶是Sal Ⅰ和Xho Ⅰ。5.根据权项1或4所述的载体，其特征在于，在Sal Ⅰ和Xho Ⅰ切点上方出现一个Eco RⅠ切点。6.根据权项1所述的载体，其特征在于，一个操纵子区和一个SD(Shjne-Dalgarno)序列是被包含在两个或更多个不同切点之间的。7.根据权项1所述的载体，其特征在于，所述的载体为质粒。8.根据权项1所述的载体，其特征在于，大肠杆菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：中川幸光，宇野修正，永井正德，有村博文，
申请(专利权)人：绿十字株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]