诱导性多能干细胞的制备方法和用于制备诱导性多能干细胞的培养基技术

本发明专利技术提供了一种诱导性多能干细胞的制备方法，该方法包括以下步骤：步骤1，将一个或多个干细胞多能性因子导入体细胞；步骤2，使用干细胞培养基对步骤1中制备的导入了干细胞多能性因子的体细胞进行培养，其中，在该过程中，进一步包括使用高渗透压培养基对所述细胞进行培养；和步骤3，鉴定诱导性多能干细胞克隆。此外，本发明专利技术还提供了一种用于制备诱导性多能干细胞的培养基。本发明专利技术提出了将提高渗透压的培养基应用于高效制备iPS中。在本发明专利技术中，高渗透压环境能够使小鼠iPS细胞的产生效率提高10-25倍。本发明专利技术提供的高效率诱导iPS细胞的方法对iPS技术安全性的提高和iPS细胞在再生医学领域的应用有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及诱导性多能干细胞的制备方法和用于制备诱导性多能干细胞的培养基。
技术介绍
胚胎干细胞被誉为"万能细胞"，从理论上讲，可分化为人体220种细胞中的任何ー种，从而构成机体各种复杂的组织器官，随着1981年小鼠胚胎干细胞和1998年人的胚胎干细胞的建系成功，再生医学的研究真正开始。胚胎干细胞的应用前景主要是用于移植治疗，以胚胎干细胞作为起始细胞，通过体外培养及定向分化，可以为临床治疗中提供 大量的组织和器官的移植材料。通过对于胚胎干细胞自我更新和定向分化机制的研究，许多特异性的细胞类型(例如神经细胞、心肌细胞等)已经具备了成熟的分化方法和相应的检测标准。它可以用于治疗帕金森氏症、脊髄损伤和糖尿病等组织器官缺损或功能障碍等多种疾病。但一直以来，为了获取人体ES细胞，必须摧毁胚胎，这一点使胚胎干细胞治疗研究ー直面临的伦理和法律等诸多障碍。于是科学家们开始寻求不通过胚胎而将分化细胞重编程直接逆转为干细胞的新方法。2006年8月，Yamanaka小组将24种转录因子排列组合导入小鼠成纤维细胞，最终确定最少有4种转录因子组合_0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4即可将小鼠成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞(Induced Pluripotent StemCells, iPS Cells) 。2007 年底，Yamanaka小组和Thomson小组先后将人的体细胞重编程为iPS细胞。2009年，研究人员首次利用iPS细胞通过四倍体囊胚注射得到存活并具有繁殖能力的小鼠，证明了 iPS细胞具有真正的全能性。iPS作为诱导产生多能性干细胞的一种技术，在临床疾病治疗方面的应用价值是巨大的，因为它不像传统的核移植或者细胞融合等获取干细胞的方式那样需要人的卵子或人的胚胎干细胞，从而绕开了伦理和法律等诸多障碍，并且它利用由成体细胞重编程为干细胞的特性避免了免疫排斥使得自体移植变得更加可行；另一方面，iPS对于干细胞自我更新机制的研究、干细胞信号调控的研究以及探索很多疾病的发病机制并寻找治疗方法都有很大意义。但是，iPS细胞的应用仍然有两大难题亟待解決生物安全问题和诱导效率问题。在生物安全问题方面，最初实验体系中过表达的外源基因中含有两个原癌基因(c-Myc，Klf-4)，并且外源基因的导入方式是通过逆转录病毒，病毒在基因组中有多个拷贝的插入也会导致基因突变及癌变。因此，大家致力于优化iPS技术以提高其应用的安全性，例如，借助转座子介导的转基因方法高效制备了无病毒(virus-free) iPS细胞;成功地从所获得的iPS细胞中移除先前导入的转录因子基因 ;iPS的诱导过程中使用特定小分子化合物，在更少的外源基因导入的情况下即可高效率获得iPS细胞;以及直接通过添加透膜的转录因子蛋白的形式进行重编程。这些发现使人们向制备无遗传修饰的iPS细胞迈出了一大歩。另外诱导效率也是制约iPS细胞技术发展和应用的ー个限速歩骤，最初iPS的诱导效率一般都低于I%，而选用小分子化合物可大幅度提高重编程效率并且减少转录因子使用个数。同时，小分子资源丰富而且组合应用灵活多样，通过加入小分子改变细胞培养环境，从而激活细胞重编程相关信号通路，提高体细胞重编程效率，这ー
正逐步为各国科学家所重视。细胞的培养环境对干细胞自我更新和分化尤为重要，通过添加利于干细胞生长的生长因子可以抑制干细胞分化，促进自我更新(例如在培养基中加入LIF (适合鼠干细胞)，加入bFGF (适合人干细胞)等等);同样在体细胞重编程过程中微环境的优化也可以显著提高iPS细胞诱导效率。除了添加相应生长因子及小分子化合物改变细胞生长微环境之外，低氧这ー物理环境的改变也可以提高人和小鼠体细胞重编程效率或者促进ES细胞自我更新等等，因此，物理环境的改变也是提高诱导重编程效率的一个值得探索的方向，对理解重编程机制也有着十分重要的作用。在以往的应用研究中，高渗环境对于ES细胞有着促进分化的作用，高渗作为ー种环境刺激胁迫细胞，通过激活p38 MAPK信号途径，改变相关转录因子表达进而诱导干细胞分化。因此，目前用于干细胞培养的培养基Knockout DMEM是经过优化后的低渗培养基，经测定其渗透压为270m0SM/kg。传统上认为，经过优化的培养基渗透压和小鼠胚胎组织渗透压接近，更适于未分化的胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的生长。 但是，在小鼠体细胞重编程过程中应用高渗环境，研究高滲透压对于小鼠体细胞重编程过程的影响，以及高渗环境如何导致相关转录因子表达的改变，目前尚无报道。因此，研究渗透压在体细胞重编程过程的作用，寻找能够提高iPS细胞诱导效率的培养条件，对推动iPS细胞的基础研究和临床应用将有巨大帮助。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术人进行了广泛和深入的研究，最終完成本专利技术。为了提高iPS细胞的诱导效率，本专利技术提供了通过改变培养基渗透压制备诱导性多能干细胞的方法，该方法包括以下步骤步骤I，将ー个或多个干细胞多能性因子导入体细胞；步骤2，使用干细胞培养基对步骤I中制备的导入了干细胞多能性因子的体细胞进行培养，其中，在该过程中，进ー步包括使用高滲透压培养基对所述细胞进行培养；以及步骤3，鉴定诱导性多能干细胞克隆。优选地，所述方法进ー步包括将报告基因导入体细胞以此通过报告基因来指示所述诱导性多能干细胞的产生及其产生效率。优选地，所述报告基因为0ct4-GFP或Nanog-GFP。且更优选地，所述报告基因为0ct4_GFP。优选地，在步骤I中，将所述干细胞多能性因子的cDNA以病毒感染方式导入小鼠胚胎成纤维细胞。优选地，在步骤I中，所述干细胞多能性因子可选自0ct4、Sox2、Soxl、Klf4、Klf2、Klf5> Nanog、c_Myc、L-Myc> N-Myc> Lin28和Esrrb中。且更优选地,所述干细胞多能性因子可为包括0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc的四因子；或者，所述干细胞多能性因子可为包括0ct4、Sox2和Klf4的三因子；或者，所述干细胞多能性因子可为包括0ct4和Sox2的ニ因子。优选地，在步骤2中，从导入所述因子后第3至6天开始使用高渗透压培养基对所述细胞进行培养I至9天。更优选地，在步骤2中，在导入所述因子后第3至第6天，或者在导入所述因子后第3至第8天，或者在导入所述因子后第3至第10天，或者在导入所述因子后第3至第12天，或者在导入所述因子后第6至第9天，使用高滲透压培养基对所述细胞进行培养。优选地，在步骤2中，所述高渗透压培养基是通过在普通等渗培养基中外加NaCl、蔗糖(sucrose)、甘露醇、Na2SO4、葡甲胺等离子型或非离子型滲透压调节物质而制备的培养基。更优选地，在所述高渗透压培养基中，用来提高渗透压的物质选自NaCl和蔗糖中。最优选地，在所述高渗透压培养基中，用来提高渗透压的物质为NaCl。优选地，在步骤2中，所述高渗透压培养基的渗透压为380-480m0SM/kg。更优选地，在四因子(0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4)感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)诱导iPS条件下，渗透压为480m0SM/kg(即在等渗培养基中外加IOOmM NaCl或200mM蔗糖)。或本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导性多能干细胞的制备方法，该方法包括以下步骤：步骤1，将一个或多个干细胞多能性因子导入体细胞；步骤2，使用干细胞培养基对步骤1中制备的导入了干细胞多能性因子的体细胞进行培养，其中，在该过程中，进一步包括使用高渗透压培养基对所述细胞进行培养；和步骤3，鉴定诱导性多能干细胞克隆。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谢欣，许新秀，张儒，
申请(专利权)人：中国科学院上海药物研究所，
类型：发明
国别省市：