本发明专利技术公开了一种来源于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)ZJB-12126的重组羰基还原酶基因及其编码酶、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，以及其在催化不对称还原前手性羰基化合物中的应用；分别以2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯、(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯和4,4,4-三氟乙酰乙酸乙酯为底物，进行生物催化反应制备高光学纯度的(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯、6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯以及(S)-4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯，可以利用重组大肠杆菌作为生物催化剂进行生物催化反应，为药物手性中间体的生物催化合成提供了可供选择的新酶源。
【技术实现步骤摘要】
一种羰基还原酶基因、编码酶、载体、工程菌及其应用(一)
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种来源于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderiagladioli)ZJB-12126的羰基还原酶基因、编码酶、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌以及在催化不对称还原前手性羰基化合物中的应用。(二)
技术介绍
羰基还原酶(Carbonylreducatase,E.C.1.1.1.x)是一类能够催化醇和醛/酮之间双向可逆氧化还原反应的酶类，并且需要辅酶NAD(H)(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)或NADP(H)(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)作为氢传递体。NADH和NADPH作为电子供体参与其还原反应，NAD和NADP则作为电子受体参与其氧化反应。目前根据文献报道的羰基还原酶大多属于短链脱氢酶超家族(Short-chaindehydrogenase/reductase，SDR)、中链醇氢酶超家族(Medium-chaindehydrogenase/reductase，MDR)、醛酮还原酶超家族(Aldo-ketoreductase，AKR)。虽然三者具有相似的催化功能，但在进化和结构上差异较大。羰基还原酶是一类非常古老的家族，广泛分布于自然界中，在各类动物、微生物和植物中，由于微生物种类繁多、分布广，是羰基还原酶的主要来源。近年来，随着基因组学、蛋白质组学和生物信息学的迅速发展，基因组和基因序列数据库中公布的基因数据的迅速增长，从大量的数据资源中寻找新型的羰基还原酶基因、挖掘其蕴含的生物学信息，为新型高效生物催化剂的开发服务已经成为现实。基因挖掘技术是一项新型酶筛选技术，目前已得到广泛地应用。利用基因挖掘已从PichiafinlandicaPfODH、ClostridiumljungdahliiBDH1、CandidaglabrataCgKR1、SerratiaquinivoransSQ_SDR、PolygonumminusPmADH、ArabidopsisthalianaAtADH、OenococcusoeniAdh3、Chryseobacteriumsp.ChKRED20、CandidamagnoliaeCmCR以及Acetobactersp.AcCR等菌株中挖掘了大量的羰基还原酶。其中部分羰基还原酶的基因已在不同的宿主(Escherichiacoli、Pichiapastoris、Arxulaadeninivorans等)中成功表达，获得产酶活力和选择性较高的基因工程菌，并成功应用于催化羰基类化合物的不对称还原反应。尽管如此，许多羰基还原酶具有底物特异性，大大限制了其应用范围。此外，许多酶的催化效率较低，也限制了其工业化应用。筛选具有较宽底物谱的新型羰基还原酶，研究其可以高效高选择性催化的羰基化合物，不仅可以拓宽其应用范围，提升其应用潜力，也为实现工业化生产奠定基础。手性醇广泛应用于手性药物和其他手性精细化学品的合成。目前手性醇的合成方法包括物理分离法、拆分法以及不对称还原法等。其中，利用前手性羰基化合物的不对称还原合成手性醇，其理论产率达100％，是目前生产手性醇的一种主要方法。化学不对称还原法主要是利用手性金属配合物作为催化剂用于羰基的不对称还原，虽然该化学方法已部分用于工业生产，但是该反应条件比较苛刻、手性金属配合物合成复杂并且价格昂贵，产物中有重金属的残留导致产物分离困难，环境污染较大，因此其应用受到了一定的限制。生物催化不对称还原法不仅具有高度的化学、区域和立体选择性，并且反应条件温和，避免了产物中的重金属残留，对环境友好，弥补了化学方法的不足，因此，近年来生物催化的羰基不对称还原反应在手性醇合成中的应用越来越受到重视。(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯是合成碳青霉烯和青霉烯类药物中间体4-乙酰氧基氮杂环丁酮(4-AA)的手性砌块。目前获得(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯中间体的主要途径是以手性催化剂(R)-BINAP-Ru配合物不对称催化2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯生成(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯。但由于该反应条件需要高压加氢、金属钌配合物的价格比较昂贵并且与产物的分离较为困难等，不利于其工业化应用。目前生物催化法合成(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯报道较少。SaccharomycopsismalangaNBRC171096催化生成(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯，并具有较高的对映选择性(对映体过量值ee>96.2％)，但是催化效率低(产率仅4％)。美国专利US20130034895研究了来源于Lactobacilluskefir的羰基还原酶催化合成(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯，具有较高的对映选择性(ee为60～99％)，但在该反应过程中，以异丙醇作为第二底物实现辅酶循环利用，由于异丙醇与底物存在竞争性抑制作用，导致最大转化率受到影响，并且副产物丙酮的生成对酶有一定的损害作用。6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯是HMG-CoA酶抑制剂阿托伐他汀类药物的手性中间体，可以通过化学合成和生物催化合成的方法获得。在化学法合成中需要使用易燃易爆的正丁基锂、硼烷，并且需要在<-65℃低温条件下进行，能耗大，再加6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯非对映诱导不充分，产物的光学纯度难以达到要求。近年来，利用酶法代替化学法改善反应条件，降低反应成本，提高产物的选择性成为研究的热点。目前已筛选到的高立体选择性催化(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯生成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的菌株有：Saccharomycescerevisiae、Pichiaangusta、Pichiahaplophila、Beauveriabassiana、Pichiapastoris、Pichiamembranefaciens、Candidahumicola、Kluyveromycesdrosophilarum、Rhodotorulaglutinis和Pichiacaribbic等。Codexis公司专利US7879585B2从Saccharomycescerevisiae中克隆了一种酮还原酶并进行了改造，催化生产6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯转化率为99.7％，de>99％。贝氟沙通(Befloxatone)化学名5(R)-(甲氧甲基)-3-[4-[4,4,4-三氟基-3(R)-羟基丁氧基]苯基]噁唑烷酮-2，是一种强选择性可逆性单胺氧化酶A(MAO-A)抑制剂，与MAO-A黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)辅因子及活性位点的特异氨基酸相互作用，临床上用来治疗抑郁症。(R)-4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯是合成贝氟沙通的手性中间体。Zhang等首先报道了菌株BacilluspumilusPhe-C3中含有NADPH依赖型羰基还原酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)，能催化4,4,4-三氟乙酰乙酸乙酯生成(R)-4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯，底物浓度为60mM时，产率达67％，ee达95％。He等人筛选到一株Saccharo本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种来源于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)ZJB‑12126的羰基还原酶基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种来源于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderiagladioli)ZJB-12126的重组羰基还原酶在不对称还原前手性羰基化合物中的应用，其特征在于所述重组羰基还原酶的氨基酸序列为SEQIDNO：2所示。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用为：以含重组羰基还原酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，于pH值为6～10的缓冲液中，加入底物，辅助底物和NAD(P)+，在20～40℃、50～250rpm条件下反应，反应完全后，获得含手性醇的混合液；所述底物为2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯、(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯和4,4,4-三氟乙酰乙酸乙酯中的一种，当所述底物为2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯时，2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯以400mmol/L二甲基亚砜溶液的形式加入；所述辅助底物为葡萄糖、甲酸铵、异丙醇或无水乙醇，当所述辅助底物为葡萄糖时，添加葡萄糖脱氢酶构成辅助底物体系，当所述辅助底物为甲酸铵时，添加甲酸铵脱氢酶构成辅助底物体系；所述催化剂的用量以湿菌体的重量计为20～200g/L缓冲液，所述底物的初始浓度为10～100mmol/L缓冲液，所述辅助底物的用量为10～200g/L缓冲液，所述葡萄糖脱脱氢酶或甲酸铵脱氢酶的用量以含葡萄糖脱氢酶或甲酸铵脱氢酶的菌体经发酵培养获得的湿菌体重量计，为20～200g/L缓冲液，所述NAD(P)+的用量为0.01～5mmol/L缓冲液。3....
【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，郑裕国，陈翔，王亚军，沈寅初，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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