本发明专利技术公开了一种与油菜苗期抗旱性关联的功能标记及其应用，该功能标记的序列如SEQ ID NO:1所示，分子量为465 bp，其在油菜抗旱育种中的应用步骤是：A、提取油菜单株的DNA；B、PCR扩增：引物序列为F：5′‑TGAGGCTGATAGGATACTGG‑3′，R：5′‑CCACGGGCACCTACATTA‑3′；C、扩增产物经1.5%浓度琼脂糖凝胶电泳分离后，分子量为465 bp的功能标记的特异性条带出现时，预测油菜单株的抗旱性较好，分子量为465 bp的功能标记的特异性条带缺失时，预测油菜单株的抗旱性较差。本发明专利技术为油菜苗期抗旱性的遗传改良提供了新的遗传标记，有效解决了常规育种方法中存在的抗旱性鉴定工作量大、周期长、易受环境影响等问题，从而显著提高了油菜抗旱育种的选择效率，加快新品种的选育步伐。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于油菜育种和分子生物学领域，更具体地涉及一种与油菜苗期抗旱性关联的功能标记，还涉及该功能标记在油菜抗旱育种中的应用。
技术介绍
干旱和水资源缺乏是世界农业生产的最大制约因素，因干旱造成的农作物产量损失超过其它自然灾害的总和。油菜是我国最重要的冬季油料作物，主要种植于长江流域，但近年来该地区季节性干旱频繁发生，严重影响油菜产量。研究表明，油菜苗期是干旱最敏感的时期之一，受旱后可造成41％的产量损失(Hashem et al.Drought stress effects on seed yield,yieldattributes,growth,cell membrane stability and gas exchange of synthesized Brassica napus L.Journal of Agronomy and Crop Science,1998,180,129-136)。因此，提高油菜的抗旱减灾能力，对于保障我国油料供给安全具有重要意义。在长期的进化过程中，作物逐渐形成了避旱、御旱和耐旱等多种干旱胁迫响应机制，其中御旱和耐旱统称为抗旱性。御旱性是植物加强根部水分吸收、减少地上部分的水分蒸发来抵御干旱的能力。耐旱性主要是通过生理和生化调节来实现的，如合成小分子糖类、醇类、醛类来提高提高渗透调节能力，防止细胞水分的散失，以及产生胁迫感应信号、启动体内的防御系统和活性氧清除系统来维持细胞结构的稳定性，从而在一定程度上减轻和缓解干旱造成的影响(景蕊莲.作物抗旱研究的现状与思考.干旱地区农业研究,1999,17:79-85)。实践证明，培育和应用抗旱性作物品种是应对农业干旱的最经济有效的手段。然而，植物抗旱性属多基因控制的数量性状，而且抗旱性鉴定周期长，易受环境因素影响，因而通过常规育种方法改良作物抗旱性的效果往往不理想。随着分子生物学的发展，利用特定的分离群体对抗旱性开展QTL分析，获得抗旱性相关的分子标记并进行标记辅助选择，则可显著提高抗旱育种的效率。比如，李真等人利用一个DH群体，利用SSR和AFLP标记对油菜苗期的抗旱性和耐渍性进行了QTL分析，共检测到28个有关的QTL(Mapping of QTLassociated with waterlogging tolerance and drought resistance during the seedling stage in oilseedrape.Euphytica,2014,197:341-353)。然而，上述传统的QTL分析和标记辅助选择存在一定的局限性，因为QTL分析的工作量很大，难以实现QTL的精细定位，而且在标记辅助选择过程中有可能因为遗传重组或遗传漂移而丢失目标基因(Collard B C,Mackill D J.Marker-assisted selection:an approach for precision plant breeding in the twenty-first century.Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B,Biological Sciences,2008,363:557-572)。利用对性状具有决定作用的、具有明确功能的基因序列开发出来的多态性标记，即功能标记进行分子标记辅助育种，则可以保证选择的准确性和选择效率，因为选择的就是基因本
身(Andersen J R,Lübberstedt T.Functional markers in plants.Trends in Plant Science,2003,8:554-560)。根据已知功能基因序列开发功能分子标记是最直接有效的方法，但是可供利用的油菜抗旱候选基因序列十分有限，尚无法满足油菜抗旱育种的技术需求。张静利用SNP标记进行全基因组关联分析，检测到16个显著关联的位点，但无法开发出功能标记供育种应用(华中农业大学博士论文，2015，武汉)。本研究通过转录组关联分析技术制备到与油菜苗期抗旱性高度关联的功能标记，并验证了该标记在育种中的应用价值。经文献查新，国内未见有关油菜苗期抗旱性的功能标记的制备及其应用的研究报道，也未见相关的专利技术公开或使用。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供一种油菜苗期抗旱性关联的功能标记，其序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，该标记为油菜抗旱育种提供新手段，加速油菜抗旱性遗传改良进程，提高育种的选择效率和准确性。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种油菜抗旱性高度关联的功能标记在油菜抗旱育种中的应用，通过该方法有效解决了常规育种方法中存在的抗旱性鉴定工作量大、周期长、易受环境影响等问题，准确率高达92.5％。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术方案：一种与油菜苗期抗旱性关联的功能标记的制备方法，其步骤是：(1)以101份遗传来源不同的油菜品种资源为研究材料(已公开，具体参见文献：陆光远等.Associative transcriptomics study dissects the genetic architecture of seed glucosinolate content in Brassica napus.DNA Research，2014，21:613-625)，在温室下生长至2片真叶。(2)用Trizol法抽取油菜幼嫩单株叶片的RNA，进行商业化mRNA-Seq测序，并进行生物信息学分析，开发获得基因表达标记(Gene Expression Marker,GEM)；(3)自然群体在干旱棚种植，苗期利用二次干旱存活法鉴定每份品种资源的抗旱性表现，根据存活率高低将抗旱性划分为5个等级(见表1)；表1油菜苗期抗旱性评价标准(4)运用统计软件R(http://www.R-project.org/)中的混合线性模型将GEM标记数据与干旱存活率进行关联分析，以显著性P<10-5(-Log10P＝5)为标准，筛选获得79个显著关联的GEM标记，其中A_EE476451标记的显著水平最高(P＝1.5E-10)。该标记对表型方差的贡献率达到23.8％。(5)从公共数据库(http://brassica.nbi.ac.uk/)查询获得候选基因EE476451的核苷酸序列，blastn搜索(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)发现该核苷酸序列与甘蓝型油菜中的一个RNA解旋酶(DEAD-box ATP-dependent RNA helicase 27-like，NCBI序列号：XM_013786005)的同源性为100％。针对EE476451的核苷酸序列设计引物并以油菜品种的DNA为模板进行PCR扩增、序列测定和比对，在序列变异位点重新设计PCR引物将其转化为特异性的功能标记EE476451-465，该标记的序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，其引物正向序列EE476451-89F为5′-TGAGGCTGATAGGATACTGG-3′，引物反向序列EE476451-554R为5′-CCACGGGCACCTACATTA-3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种与油菜苗期抗旱性关联的功能标记，其序列为SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种与油菜苗期抗旱性关联的功能标记，其序列为SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。2.一种与油菜苗期抗旱性关联的功能标记的扩增引物，其特征在于，正向引物序列为5′-TGAG...
【专利技术属性】
技术研发人员：陆光远，黄倩，赵永国，张学昆，乔醒，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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