ApoE基因引物组、检测试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术涉及DNA检测技术领域，提供了一种ApoE基因引物组、检测试剂盒和检测方法，其中包括分别检测rs429358位点的引物组和rs7412位点的引物组；检测rs429358位点的引物组中的上游引物具有SEQ ID NO：1-4中的任一种序列，检测rs429358位点的引物组中的下游引物具有SEQ ID NO：5-8中的任一种序列；检测rs7412位点的引物组中的上游引物具有SEQ ID NO：9-12中的任一种序列，检测rs7412位点的引物组中的下游引物具有SEQ ID NO：13-16中的任一种序列。本发明专利技术的引物组、试剂盒及方法能够提高ApoE基因检测过程中正确信号的比例。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及DNA检测
，更具体地说，涉及一种APOE基因引物组、检测试剂盒和检测方法。
技术介绍
ApoE基因与多种心脑血管疾病密切相关，其编码的载脂蛋白E（ApolipoproteinE，ApoE）参与高血脂症、动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病的整个发生发展过程，ApoE基因多态性是这些疾病早期及发展过程中个体差异的主要原因。根据ApoE表型提出ApoE基因模型，认为ApoE的合成是由位于一个基因位点上的三个等位基因所控制，即E2、E3和E4，每一个等位基因对应于一个主要异构体产生三种纯合子(E2/2，E3/3，E4/4)和三种杂合子(E2/3，E2/4，E3/4)共六种常见表型。ApoE3/3型又称野生型。ApoE是一个多态性蛋白，有三个常见的异构体，即E2、E3和E4。ApoE的氨基酸序列的112位（Cys112Arg，rs429358，以下简称358）和158位（Arg158Cys，rs7412，以下简称412）两种氨基酸残基即精氨酸（Arg）和半胱氨酸（Cys）的交换决定了异构体的种类。ApoE4在这两个位置上都是Arg；E2都是Cys；112位为Cys和158位是Arg者为ApoE3异构体。自然人群中，基因频率E3分布最高，ApoE3/3表型分布约70%。另外国内外多项研究发现，ApoE基因是目前已知的阿尔茨海默病最密切的遗传标志物，ApoE4携带者阿尔茨海默病的易感性增加。ApoE突变后，其与LDL-R的亲和力发生改变。携带一个E4等位基因的个体其发展为AD的可能性高于无E4等位基因的个体约3-4倍。E4等位基因在普通人群中比例大约为15%，而在AD患者中的比例可达40%。ApoE4是AD的重要危险因素。通过检测ApoE的基因型，可了解是否为AD易感人群，继而从病因学延缓AD的发生、发展；并定期检查，以便早诊断、早治疗、最大程度的降低疾病造成的损害。目前对基因突变和基因多态性的检测，常见有直接测序法、基因芯片杂交法、Taqman荧光探针法、等位基因特异性扩增法（Amplification Refractory Mutation SystemReal Time PCR，ARMS-RT PCR）、等位基因特异性扩增法（Amplification Refractory Mutation System Real TimePCR，ARMS-RT PCR）等。其中，直接测序法准是突变分析的金标准，能发现已知突变和未知突变，其包括以Sanger技术为基础的第一代测序技术，和具有高通量、低成本特点的第二代高通量测序技术。第二代高通量测序技术包括连接测序法和合成测序法。其中，所述连接测序法是基于连接酶在核酸片段之间进行连接反应的过程中的保真性来实现的，以待测序核酸片段为模板，锚定引物（又称测序引物，其与待测序核酸片段所在链互补）和寡核苷酸探针（该探针的特定位置上带有荧光标记）进行连接反应，通过检测连接产物上的荧光标记从而确定寡核苷酸探针上带有荧光标记的特定位置对应的序列的信息。所述合成测序法是基于聚合酶在延伸核酸链过程中的保真性来实现的，以待测序核酸片段为模板，锚定引物互补结合至待测序核酸片段上，通过检测在延伸过程中产生的信号来确定待测序核酸片段上相应位置的序列信息。因为在高通量基因测序过程中，某一位点的基因序列的测定，是通过观察成千上万甚至更多个待测模板在进行该位点检测时的信号，经统计分析后得出的，因此如何提高这些信号中正确信号的比例，对于降低分析的难度，解决假阳性或假阴性的问题是至关重要的。因此需要一种新的ApoE基因检测引物、检测试剂盒和检测方法，以提高ApoE基因检测过程中正确信号的比例。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种ApoE基因检测引物、检测试剂盒和检测方法，旨在解决现有技术中测序结果中存在较高比例的错误信号的技术问题。为了实现专利技术目的，本专利技术提供了一种ApoE基因引物组，包括分别检测rs429358位点的引物组和rs7412位点的引物组；所述检测rs429358位点的引物组中的上游引物具有SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4序列，所述检测rs429358位点的引物组中的下游引物具有SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8序列；所述检测rs7412位点的引物组中的上游引物具有SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12序列，所述检测rs7412位点的引物组中的下游引物具有SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16序列。优选的，所述检测rs429358位点的引物组中的一种上游引物和/或下游引物上含有可断裂位点；所述检测rs7412位点的引物组中的一种上游引物和/或下游引物上含有可断裂位点。优选的，所述检测rs429358位点的引物组有两对，分别为358外引物对和358内引物对；所述检测rs7412位点的引物组有两对，分别为412外引物对和412内引物对；所述358内引物对中的上游引物和/或下游引物上含有可断裂位点；所述412内引物对中的上游引物和/或下游引物上含有可断裂位点。为了更好的实现本专利技术的目的，本专利技术还提供了一种ApoE基因检测试剂盒，所述试剂盒含有上述的任一种ApoE基因引物组。优选的，所述试剂盒还包括无荧光标记的寡核苷酸探针。优选的，所述试剂盒还包括连接缓冲液，所述连接缓冲液中含有PEG。优选的，所述试剂盒还包括接头，所述接头用于直接与所述检测rs429358位点的引物组的扩增产物连接，也用于直接与所述检测rs7412位点的引物组的扩增产物连接。更优选的，所述接头上含有标签序列。所述标签序列用于识别待测样本来源和所检测的SNP位点。优选的，所述试剂盒还包括检测rs429358位点的锚定引物和检测rs7412位点的锚定引物。更优选的，所述锚定引物上用于连接寡核苷酸探针的一端距待测SNP位点1至9bp之间，更优选在1至5bp之间。更优选的，针对rs429358，所述锚定引物为SEQ ID NO：21，针对rs7412，所述锚定引物为SEQ ID NO：22。更优选的，所述试剂盒还包括检测标签序列的锚定引物。更优选的，针对标签序列，所述锚定引物为SEQ ID NO：23。为了更好的实现本专利技术的目的，本专利技术还提供了一种基于上述任一种ApoE基因引物组的ApoE基因检测方法，包括以下步骤：A、利用检测rs429358位点的引物组和rs7412位点的引物组分别对待测样本进行PCR扩增，得含rs429358位点的扩增产物和含rs7412位点的扩增产物；B、将含rs429358位点的扩增产物和含rs7412位点的扩增产物分别直接与接头连接，形成rs429358待测序文库分子和rs7412待测序文库分子，并将rs429358待测序文库分子和rs7412待测序文库分子分别通过微球可寻址的固定在固相载体上；C、利用无荧光标记的寡核苷酸探针替换有荧光标记的寡核苷酸探针，对固定在固相载体上的rs429358待测序文库分子和rs7412待测序文本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ApoE基因引物组，其特征在于，包括分别检测rs429358位点的引物组和rs7412位点的引物组；所述检测rs429358位点的引物组中的上游引物具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4序列，所述检测rs429358位点的引物组中的下游引物具有SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8序列；所述检测rs7412位点的引物组中的上游引物具有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12序列，所述检测rs7412位点的引物组中的下游引物具有SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16序列。

【技术特征摘要】
1.一种ApoE基因引物组，其特征在于，包括分别检测rs429358位点的引物组和rs7412位点的引物组；所述检测rs429358位点的引物组中的上游引物具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4序列，所述检测rs429358位点的引物组中的下游引物具有SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8序列；所述检测rs7412位点的引物组中的上游引物具有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12序列，所述检测rs7412位点的引物组中的下游引物具有SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16序列。2.根据权利要求1所述的ApoE基因引物组，其特征在于，所述检测rs429358位点的引物组中的一种上游引物和/或下游引物上含有可断裂位点；所述检测rs7412位点的引物组中的一种上游引物和/或下游引物上含有可断裂位点。3.根据权利要求2所述的ApoE基因引物组，其特征在于，所述检测rs429358位点的引物组有两对，分别为358外引物对和358内引物对；所述检测rs7412位点的引物组有两对，分别为412外引物对和412内引物对；所述358内引物对中的上游引物和/或下游引物上含有可断裂位点；所述412内引物对中的上游引物和/或下游引物上含有可断裂位点。4.一种ApoE基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1、2或3所述的ApoE基因引物组。5.根据权利要求4所述的ApoE基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括无荧光标记的寡核苷酸探针。6.根据权利要求4所述的ApoE基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括连接缓冲液，所述连接缓冲液中含有PEG。7.根据权利要求4所述的ApoE基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括接头，所述接头用于直接与所述检测rs429358位点的引物组的扩增产物连接，也用于直接与所述检测rs7412位点的引物组的扩增产物连接，所述接头上含有标签序列。8.根据权利要求4所述的ApoE基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测rs429358位点的锚定引物、检测rs7412位点的锚定引物和检测标签序列的锚定引物。9.一种基于权利要求1、2或3所述的ApoE基因引物组的ApoE基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤：A、利用检测rs429358位点的引物组和rs7412位点的引物组分别对待测样本进行PCR扩增，得含rs429358位点的扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛司潼，邓波，
申请(专利权)人：武汉康昕瑞基因健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42