EGFR基因突变检测引物组、探针、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及基因工程及分子生物学领域，一种EGFR基因突变检测引物及探针，用于扩增和检测含T790M位点的核酸片段，所述引物包括特异性引物和特异性探针，特异性引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物为SEQ ID NO:1，所述下游引物为SEQ ID NO:2，所述特异性探针为SEQ ID NO:3，所述特异性探针的5’末端连接荧光报告基团，3’末端连接荧光淬灭基团，所述上游引物的3’端第二位包括人工错配碱基A。本发明专利技术EGFR基因突变检测引物及探针使用简便。

EGFR gene mutation detection primers, probes, kits and detection methods

The present invention relates to the field of genetic engineering and molecular biology. An EGFR gene mutation detection primer and probe are used to amplify and detect nucleic acid fragments containing T790M locus. The primers include specific primers and specific probes, and the specific primers include upstream and downstream primers. The upstream primers are SEQ ID NO:1, and the downstream primers are SEQ ID NO:2. The probe is SEQ ID NO:3. The 5'end of the specific probe connects with the fluorescence reporting group, and the 3' end connects with the fluorescence quenching group. The 3'end of the upstream primer includes the artificial mismatch base A. The EGFR gene mutation detection primer and probe of the invention are simple to use.

【技术实现步骤摘要】
EGFR基因突变检测引物组、探针、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及基因工程及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种EGFR基因突变检测引物、探针、试剂盒及检测方法。
技术介绍
表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）是细胞表面受体酪氨酸激酶HER/ErbB家族成员，广泛分布于人体多种正常组织的细胞膜上，对细胞的增殖、迁移起到重要的作用。EGFR基因编码区的突变主要发生在外显子18-21上，其中18，19，21号外显子上的突变为药物敏感性突变，20号外显子上的突变为耐药突变，通过检测EGFR基因突变对于指导病人临床用药具有重要的参考价值。目前DNA测序法仍然是检测EGFR基因突变使用最多的方法，但需要获取肿瘤组织、分离肿瘤细胞、提取核酸和进行测序，所需时间长、费用高，对取材和技术要求都比较严格，因此应用于临床仍受到一定程度的限制。因此，本专利技术的目的是提供一种简便、快速、准确和经济的EGFR基因突变检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种EGFR基因突变检测引物、探针，旨在解决现有技术中EGFR基因突变检测比较复杂的问题。一种EGFR基因突变检测引物及探针，用于扩增和检测含T790M位点的核酸片段，所述引物包括特异性引物和特异性探针，特异性引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物为SEQIDNO:1，所述下游引物为SEQIDNO:2，所述特异性探针为SEQIDNO:3，所述特异性探针的5’末端连接荧光报告基团，3’末端连接荧光淬灭基团，所述上游引物的3’端第二位包括人工错配碱基A。进一步地，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1。进一步地，所述的EGFR基因突变检测引物及探针还包括内控引物和内控探针，所述内控引物包括内控上引物和内控下引物；所述内控上引物为SEQIDNO:4，所述内控下引物为SEQIDNO:5，所述内控探针为SEQIDNO:6。一种EGFR基因突变检测特异性引物及特异性探针，用于扩增和检测含T790M位点的核酸片段，所述引物包括特异性引物和特异性探针，特异性引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物为SEQIDNO:7，所述下游引物为SEQIDNO:8，所述特异性探针为SEQIDNO:9，所述特异性探针的5’末端连接荧光报告基团，3’末端连接荧光淬灭基团，所述上游引物的3’端第二位和第三位包括人工错配碱基AA。进一步地，所述的EGFR基因突变检测引物及探针还包括内控引物和内控探针，所述内控引物包括内控上引物和内控下引物；所述内控上引物为SEQIDNO:4，所述内控下引物为SEQIDNO:5，所述内控探针为SEQIDNO:6。进一步地，所述试剂盒包括权利要求上述的EGFR基因突变检测引物及探针。进一步地，所述的EGFR基因突变检测引物及探针还包括所述试剂盒还包括PCR缓冲液；dNTP混合液；DNA聚合酶；Mg2+。进一步地，所述的EGFR基因突变检测引物及探针还包括所述DNA聚合酶为热启动DNA聚合酶。进一步地，所述的EGFR基因突变检测引物及探针还包括所述热启动DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶或UNG酶。一种EGFR基因突变检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：A、利用上述的EGFR基因突变检测引物、探针对含待测位点的核酸片段进行单管实时荧光PCR扩增；B、获取特异性探针的荧光值CtFAM以及内控探针的荧光值CtVIC，计算二者差值△Ct=CtFAM-CtVIC用于判断检测结果，当△Ct小于10表示含待测位点的核酸片段具有EGFR基因T790M突变，否则表示含待测位点的核酸片段没有EGFR基因T790M突变。本专利技术提供的EGFR基因检测试剂盒，采用特异性扩增引物组和探针对含T790M位点的EGFR基因片段进行扩增，并检测T790M位点的突变情况，本专利技术通过ARMS-PCR技术进行基因突变检测，能够简便、快速、准确的检测出T790M位点的基因突变。附图说明图1为一实施例阳性样本的检测信号强度曲线图。图2为一实施例阴性样本的检测信号强度曲线图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。本专利技术第一实施例提供一种EGFR基因突变检测引物及探针，用于扩增和检测含T790M位点的核酸片段。所述引物包括特异性引物和特异性探针，特异性引物包括上游引物和下游引物。本实施例中。所述上游引物为SEQIDNO:1，所述下游引物为SEQIDNO:2，所述特异性探针为SEQIDNO:3。本实施例中，所述特异性探针的5’末端连接荧光报告基团，3’末端连接荧光淬灭基团，所述上游引物的3’端第二位包括人工错配碱基A。本实施例根据Cosmic数据公布的人类表皮生长因子受体（EGFR）基因20外显子的野生型基因序列和突变型基因序列，设计了具有人工错配碱基A的高特异性的扩增引物和荧光探针，采用ARMS-PCR技术，对含T790M位点进行检测，能够简便、快速、准确的检测出T790M位点的基因突变。由于本实施例设计的特异性扩增引物的3’末端设计为与突变基因的模板碱基互补，从而在后续检测基因突变过程中，将具有某种点突变的模板与正常模板区分。只有引物3’末端完全配对时，才能正常扩增，当引物3’末端发生错配时，不能有效扩增。在引物3’端第二位额外引入一位错配碱基A，使对于野生型模板，有2个错配碱基，扩增效率下降；而对于T790M突变的模板，只有1错配，且不在3’末端，仍能特异性扩增；从而能够灵敏检测T790M突变。需要说明的是，本实施例E-20-M1-F1的3’末端还可以替换为A。本实施例的特异性探针的3’末端的荧光淬灭基团能够吸收5’端荧光报告基团的荧光信号。优选的，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1。BHQ1本身不产生荧光，所有荧光背景低，灵敏度高。本专利技术第二实施例提供一种EGFR基因突变检测引物及探针，用于扩增和检测含T790M位点的核酸片段。所述引物包括特异性引物和特异性探针，特异性引物包括上游引物和下游引物。本实施例中。所述上游引物为SEQIDNO:7，所述下游引物为SEQIDNO:8，所述特异性探针为SEQIDNO:9。本实施例中，所述特异性探针的5’末端连接荧光报告基团，3’末端连接荧光淬灭基团，所述上游引物的3’端第二位和第三位包括人工错配碱基AA。本实施例根据Cosmic数据公布的人类表皮生长因子受体（EGFR）基因20外显子的野生型基因序列和突变型基因序列，设计了两个人工错配碱基AA的高特异性的扩增引物和荧光探针，采用ARMS-PCR技术，对含T790M位点进行检测，能够简便、快速、准确的检测出T790M位点的基因突变。由于本实施例设计的特异性扩增引物的3’末端设计为与突变基因的模板碱基互补，从而在后续检测基因突变过程中，将具有某种点突变的模板与正常模板区分。只有引物3’末端完全配对时，才能正常扩增，当引物3’末端发生错配时，不能有效扩增。在引物3’端第二位和第三位额外引入两位错配碱基AA，使对于野生型模板，有3个错配碱基，扩增效率大幅下降；而对于T790M突变的模板，只有2错配，且不在3’末端，仍能特异性扩增；从而能够非常灵敏检测T790M突变。需要说明本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种EGFR基因突变检测引物及探针，用于扩增和检测含T790M位点的核酸片段，所述引物包括特异性引物和特异性探针，特异性引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物为SEQ ID NO:1，所述下游引物为SEQ ID NO:2，所述特异性探针为SEQ ID NO:3，所述特异性探针的5’末端连接荧光报告基团，3’末端连接荧光淬灭基团，所述上游引物的3’端第二位包括人工错配碱基A。

【技术特征摘要】
2017.08.11 CN 20171068722671.一种EGFR基因突变检测引物及探针，用于扩增和检测含T790M位点的核酸片段，所述引物包括特异性引物和特异性探针，特异性引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物为SEQIDNO:1，所述下游引物为SEQIDNO:2，所述特异性探针为SEQIDNO:3，所述特异性探针的5’末端连接荧光报告基团，3’末端连接荧光淬灭基团，所述上游引物的3’端第二位包括人工错配碱基A。2.根据权利要求1所述的EGFR基因突变检测引物及探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1。3.根据权利要求1所述的EGFR基因突变检测引物及探针，其特征在于，进一步包括内控引物和内控探针，所述内控引物包括内控上引物和内控下引物；所述内控上引物为SEQIDNO:4，所述内控下引物为SEQIDNO:5，所述内控探针为SEQIDNO:6。4.一种EGFR基因突变检测特异性引物及特异性探针，用于扩增和检测含T790M位点的核酸片段，所述引物包括特异性引物和特异性探针，特异性引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物为SEQIDNO:7，所述下游引物为SEQIDNO:8，所述特异性探针为SEQIDNO:9，所述特异性探针的5’末端连接荧光报告基团，3’末端连接荧光淬灭基团，所述上游引物的3...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛司潼，周璐，刘程捷，万培星，李建军，童灿，
申请(专利权)人：武汉康昕瑞基因健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42