一种检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的组合物、试剂盒、样品处理方法和应用技术

本发明专利技术属于一种生物医学领域临床检测技术中的核酸检测技术领域，具体是涉及到一种检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的组合物、试剂盒、样品处理方法和应用，所述组合物包括针对用于检测待检样品中分别与ApoE和SLCO1B1基因相关的特异性目的基因的引物和探针，以及内标引物和内标探针，本发明专利技术的引物相互不干扰，能够在四个单个PCR反应管内同时检测出样品中人类APOE和SLCO1B1基因型，实现多重检测，特异性高，灵敏度好，重复性好。

【技术实现步骤摘要】
一种检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的组合物、试剂盒、样品处理方法和应用
本专利技术属于一种生物医学领域临床检测技术中的核酸检测
，具体是涉及到一种检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的组合物、试剂盒、样品处理方法和应用。
技术介绍
聚合酶链式反应(PCR)技术是当前核酸检测中最常用技术之一，其中采用荧光标记的taqman探针法的实时荧光PCR技术在核酸检测、临床诊断及分子生物学研究等方面的应用已经非常成熟，该技术已经应用到实验室研究、食品安全、医药卫生等众多行业中，但是这些技术大多采用单个反应管检测单一靶核苷酸，当在单个反应管检测多个靶核苷酸时，由于要同时引入检测不同靶核苷酸的引物和探针序列，这些引入的引物和探针会因为互相之间存在杂交而产生干扰，同时因为人类APOE基因的388位点、526位点，SLCO1B1基因的388位点、521位点皆仅有一个点突变，非常困难找到既能区别野生型和突变型，且又能在单管中不会互相干扰的引物探针设计。同时，作为一个试剂盒，需要规避假阴性就需要加入内对照靶核酸序列以及能检测内对照靶核酸序列的引物探针，加剧了单管多重PCR技术的困难。目前，基因分型的方法主要有测序法、聚合酶链反应-限制性长度多态性技术、芯片法、以及荧光定量PCR法等。这些技术都必须经过繁琐的核酸提取、纯化过程来获得较高纯度的模板DNA。增加操作的步骤，费时费力，且增加人为操作误差导致的假阳性率和假阴性率。如申请公布号为CN104846085A的专利公开了一种人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，HotStartTaq酶，UNG酶，4组特异性引物，4组特异性探针和内标系统，在同一反应管中检测同一基因两种多态性，操作简便，能在90分钟内完成检测结果判读方法简单客观，便于分析。但是，需要经过复杂的核酸提取及纯化步骤，容易造成污染及核酸损失，而且MGB分型探针对SNP位点的容忍程度很低，如若靶点位置周围有其他突变，容易造成假阴性。申请公布号CN106544419A的专利公开了一种用于检测SLCO1B1和ApoE基因多态性的引物、探针及试剂盒，包括针对不同基因位点分别设计野生型和突变型ARMS引物和Taqman-MGB探针，结合荧光定量PCR反应，对从样本提取的基因组DNA进行检测，一次性就可以实现对载体蛋白E(ApoE)基因T388C和C526T、有机阴离子转运多肽1B1编码基因(SLCO1B1)A388G和T521C的基因多态性进行检测，通过实时荧光PCR仪上收集信号，计算野生型和突变型的△Ct值来确定样本DNA的基因型。但是，一个样本做两次PCR反应，其结果判断方法无法客观排除因模板DNA上样量的误差而引起的ΔCt值变化，从而导致结果判断错误。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的组合物、试剂盒、样品处理方法和应用，其引物相互不干扰，能够在四个单个PCR反应管内同时检测出样品中人类APOE和SLCO1B1基因型，实现多重检测，特异性高，灵敏度好，重复性好。本专利技术的内容包括一种用于检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的组合物，所述组合物包括针对用于检测待检样品中分别与ApoE和SLCO1B1基因相关的特异性目的基因的引物和探针，以及内标引物和内标探针；所述引物包括：(1)引物序列为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3，用于检测APOE基因388位点多态性，(2)引物序列为SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6，用于检测APOE基因526位点多态性，(3)引物序列为SEQIDNO.7、SEQIDNO.8和SEQIDNO.9，用于检测SLCO1B1基因388位点多态性，(4)引物序列为SEQIDNO.10、SEQIDNO.11和SEQIDNO.12用于检测SLCO1B1基因521位点多态性；所述探针包括：(1)探针序列为SEQIDNO.15，用于检测APOE基因388位点多态性共用探针，(2)探针序列为SEQIDNO.16，用于检测APOE基因526位点多态性共用探针，(3)探针序列为SEQIDNO.17，用于检测SLCO1B1基因388位点多态性共用探针，(4)探针序列为SEQIDNO.18，用于检测SLCO1B1基因521位点多态性共用探针。优选的，序号为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11的引物为锁核酸修饰的ARMS引物。优选的，所述内标引物的序列为SEQIDNO.13和SEQIDNO.14，所述内标探针的序列为SEQIDNO.19。优选的，所述探针序列中，探针序列为SEQIDNO.15和/或SEQIDNO.16，其5’端修饰有FAM，3’端修饰有BHQ1；探针序列为SEQIDNO.17和/或SEQIDNO.18，其5’端修饰有CY5，3’端修饰有BHQ2。所述内标探针的5’端修饰有VIC,3’端修饰有BHQ1。本专利技术还提供一种检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒，包括所述的组合物；组合物中含有：PCR检测试剂A、PCR检测试剂B、PCR检测试剂C和PCR检测试剂D。所述PCR检测试剂A包括：SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.15、SEQIDNO.17、SEQIDNO.19的多种引物和探针，检测APOE基因388位点、526位点野生型；所述PCR检测试剂B包括：SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.15、SEQIDNO.17、SEQIDNO.19的多种引物和探针，检测APOE基因388位点、526位点突变型；所述PCR检测试剂C包括：SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16、SEQIDNO.18、SEQIDNO.19的多种引物和探针，检测SLCO1B1基因388位点、521位点野生型；所述PCR检测试剂D包括：SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16、SEQIDNO.18、SEQIDNO.19的多种引物和探针，检测SLCO1B1基因388位点、521位点突变型。单个PCR反应管中含有的taqDNApolymerase、氯化镁、dNTPs(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)、内对照核酸、靶核酸引物对、内对照核酸引物对、两种靶核酸探针和内对照核酸探针。其中各种探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团检测波长互不相同。本专利技术采用实时荧光PCR方法，所述实时荧光PCR方法所检测的样品是含有靶核酸的离体样品，如血液、血液制品、脱落细胞等。所述实时荧光PCR方法仅限于对离体样品的检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的组合物，其特征是，所述组合物包括针对用于检测待检样品中分别与ApoE和SLCO1B1基因相关的特异性目的基因的引物和探针，以及内标引物和内标探针；所述引物包括：(1)引物序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，用于检测APOE基因388位点多态性，(2)引物序列为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，用于检测APOE基因526位点多态性，(3)引物序列为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9，用于检测SLCO1B1基因388位点多态性，(4)引物序列为SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12，用于检测SLCO1B1基因521位点多态性；所述探针包括：(1)探针序列为SEQ ID NO.15，用于检测APOE基因388位点多态性共用探针，(2)探针序列为SEQ ID NO.16，用于检测APOE基因526位点多态性共用探针，(3)探针序列为SEQ ID NO.17，用于检测SLCO1B1基因388位点多态性共用探针，(4)探针序列为SEQ ID NO.18，用于检测SLCO1B1基因521位点多态性共用探针。...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的组合物，其特征是，所述组合物包括针对用于检测待检样品中分别与ApoE和SLCO1B1基因相关的特异性目的基因的引物和探针，以及内标引物和内标探针；所述引物包括：(1)引物序列为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3，用于检测APOE基因388位点多态性，(2)引物序列为SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6，用于检测APOE基因526位点多态性，(3)引物序列为SEQIDNO.7、SEQIDNO.8和SEQIDNO.9，用于检测SLCO1B1基因388位点多态性，(4)引物序列为SEQIDNO.10、SEQIDNO.11和SEQIDNO.12，用于检测SLCO1B1基因521位点多态性；所述探针包括：(1)探针序列为SEQIDNO.15，用于检测APOE基因388位点多态性共用探针，(2)探针序列为SEQIDNO.16，用于检测APOE基因526位点多态性共用探针，(3)探针序列为SEQIDNO.17，用于检测SLCO1B1基因388位点多态性共用探针，(4)探针序列为SEQIDNO.18，用于检测SLCO1B1基因521位点多态性共用探针。2.如权利要求1所述的用于检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的组合物，其特征是，序号为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11的引物为锁核酸修饰的ARMS引物；所述内标引物的序列为SEQIDNO.13和SEQIDNO.14，所述内标探针的序列为SEQIDNO.19。3.如权利要求1-2任一项所述的用于检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的组合物，其特征是，所述探针序列中，探针序列为SEQIDNO.15和/或SEQIDNO.16，其5’端修饰有FAM，3’端修饰有BHQ1；探针序列为SEQIDNO.17和/或SEQIDNO.18，其5’端修饰有CY5，3’端修饰有BHQ2。所述内标探针的5’端修饰有VIC，3’端修饰有BHQ1。4.一种检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒，包括如权利要求1-3任一项所述的组合物，所述组合物含有PCR检测试剂A、PCR检测试剂B、PCR检测试剂C和PCR检测试剂D；所述PCR检测试剂A包括：SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.15、SEQIDNO.16、SEQIDNO.19的多种引物和探针；所述PCR检测试剂B包括：SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.15、SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：文荻琛，李仁君，覃武明，罗哲容，
申请(专利权)人：湖南健基生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43