检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物、试剂盒、方法及应用技术

本申请公开了一种检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物、试剂盒、方法及应用，用于对CYP2C9和VKORC1基因进行分型。本申请提供的检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒及其方法，通过提供一组用于检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物，组合物内的引物与探针互不干扰、且无交叉污染，可在单个PCR反应管内的进行多重检测，即在单个PCR反应管内实现对多个靶核酸的扩增反应与荧光信号采集。与现有的检测方法相比，本申请的检测过程中，使用的反应管数量较少，且无需多次、重复的进行PCR扩增与荧光信号采集动作，使检测过程得到简化，节省了大量的人力、财力。

Composition, kit, method and application of CYP2C9 and VKORC1 gene polymorphism detection

【技术实现步骤摘要】
检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物、试剂盒、方法及应用
本申请涉及生物医学领域临床检测技术中的和核酸检测
，尤其涉及检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物、试剂盒、方法及应用。
技术介绍
华法林是目前临床常用的口服抗凝药，广泛用于深静脉血栓、慢性房颤、肺栓塞及心脏掰膜置换术后的治疗。作为口服抗凝药，华法林在很多方面有其不可取代性，但是由于华法林本身的一些特点，如有效治疗窗窄、个体间剂量差异大，导致其临床使用严重不足，影响了疗效的发挥。现有研究表明，CYP2C9和VKORC1基因多态性很大程度上与华法林计量个体间差异相关，因此，根据患者CYP2C9和VKORC1基因型来指导华法林剂量，比传统的经验型剂量调整用药，对患者的疗效获益及避免出血等不良事件的发生有重要意义。目前，检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的方法多种，包括测序法、聚合酶链反应-限制性长度多态性技术、芯片法以及荧光定量PCR法等。其中，荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，但该方法检测基因多态性一般采用单个反应管检测单一靶核苷酸，这就造成检测过程中需要较多的反应管，且每个反应管都需要进行重复的PCR扩增与荧光信号采集动作，从而造成检测过程繁杂，且费时、费力。若在单个反应管检测多个靶核苷酸，由于要同时引入检测不同靶核苷酸的引物和探针序列，这些引入的引物和探针会因为互相之间存在杂交而产生干扰。CYP2C9基因430位点、1075位点与VKORC1基因-1639位点皆有一个点突变，较难找到既能区别野生型和突变型，且又能在单管中不会互相干扰的引物探针设计。同时，检测过程中，为了规避假阴性，需要加入内对照靶核酸序列以及能检测内对照靶核酸序列的引物探针，进一步加剧了单管多重PCR技术的困难。另外，待检样品通常需经过繁琐的核酸提取、纯化过程来获得较高纯度的模板DNA，增加操作的步骤，费时费力，同时也增加人为操作误差导致的假阳性率和假阴性率。
技术实现思路
本申请提供了一种检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物、试剂盒、方法及应用，以解决现有的CYP2C9和VKORC1基因多态性检测过程中，需要采用单个反应管检测单一靶核苷酸，造成检测过程繁杂、费时费力的问题。第一方面，本申请提供了一种检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物，其特征在于，包括用于检测CYP2C9基因430位点、1075位点和VKORC1基因-1639位点多态性的引物，其中，所述检测CYP2C9基因430位点多态性的引物包括序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的引物；所述CYP2C9基因1075位点多态性的引物包括序列如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的引物；所述VKORC1基因-1639位点多态性的引物包括序列如SEQIDNO7、SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所示的引物；所述组合物还包括用于检测CYP2C9基因430、1075位点和VKORC1基因-1639位点多态性的探针，其中，检测所述CYP2C9基因430位点多态性的探针序列为SEQIDNO.12；检测所述CYP2C9基因1075位点多态性的探针序列为SEQIDNO.13；检测所述VKORC1基因-1639位点多态性的探针序列为SEQIDNO.14。可选地，所述组合物还包括用于检测CYP2C9和VKORC1基因430位点、1075位点、-1639位点多态性的内标引物及内标探针，所述内标引物序列如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示，所述内标探针序列如SEQIDNO.15所示。第二方面，本申请还提供了一种检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒，所述试剂盒含有PCR检测试剂A和PCR检测试剂B，其中，所述PCR检测试剂A包含序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.15的多种引物和探针；所述PCR检测试剂B包含序列分别如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.15、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11的多种引物和探针。可选地，所述样本溶解液包含Tris-HCl缓冲液、十二烷基硫酸钠、EDTA、甘油和蛋白酶K。可选地，所述试剂盒还包括野生型对照品、突变型对照品和空白对照品，其中，所述野生型对照品为包含有CYP2C9和VKORC1基因多态性位点430位点、1075位点、-1639位点的野生型重组质粒以及包含有内标基因的重组质粒的混合物；所述突变型对照品为包含有CYP2C9和VKORC1基因多态性位点430位点、1075位点、-1639位点的突变型重组质粒以及包含有内标基因的重组质粒的混合物；所述空白对照为不包含CYP2C9和VKORC1基因多态性位点及内标基因的生理盐水。第三方面，本申请还提供了一种检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的方法，包括如下步骤：1)取预处理好的基因组核酸样本2份，将2份基因组核酸样本分别与所述PCR检测试剂A和PCR检测试剂B混合，其中，SEQIDNO.14、SEQIDNO.13、SEQIDNO.12所示探针分别被ROX、Cy5、FAM荧光标记，SEQIDNO.15所示探针被VIC或HEX荧光标记；进行PCR扩增反应，采集FAM、Cy5、ROX以及HEX荧光信号；2)结果判断：当野生型对照品和突变型对照品有FAM、Cy5、ROX以及HEX荧光信号起线，空白对照均无FAM、Cy5、ROX以及HEX荧光信号起线，样品检测管VIC或HEX的CT≤35时，判断实验成功；根据两个样品检测管A、B中FAM荧光信号的ΔCt值情况判读CYP2C9基因430位点的分型，根据两个样品检测管A、B中Cy5荧光信号的ΔCt值情况判读CYP2C9基因1075位点的分型，根据两个样品检测管A、B中ROX荧光信号的ΔCt值情况判读VKORC1基因-1639位点的分型。可选地，PCR扩增反应的反应条件具体包括：UNG酶反应的反应温度50℃、持续时间2分、循环数1次；Taq酶活化的反应温度95℃、持续时间5分、循环数1次；cDNA/DNA变性的反应温度95℃、持续时间15秒、循环数5次；退火、延伸的反应温度58℃、持续时间32秒、循环数5次；cDNA/DNA再变性的反应温度95℃、持续时间15秒、循环数40次；退火、延伸及荧光采集的反应温度60℃、持续时间32秒、循环数40次；仪器冷却的冷却温度25℃、持续时间10秒、循环数1次。可选地，基因分型判读遵循如下规则：当SEQIDNO.15所示探针被VIC荧光标记时，CtHEX为CtVIC；若ROX/Cy5/FAM判定无Ct值，则默认为Ct值为40，将各Ct值列入基因型计算公式中计算ΔCt值，并根据计算的ΔCt值与基因型的对应关系，判读基因分型，其中，基因型计算公式为：ΔCtF本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物，其特征在于，包括用于检测CYP2C9基因430位点、1075位点和VKORC1基因‑1639位点多态性的引物，其中，所述检测CYP2C9基因430位点多态性的引物包括序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物；所述CYP2C9基因1075位点多态性的引物包括序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物；所述VKORC1基因‑1639位点多态性的引物包括序列如SEQ ID NO7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的引物；所述组合物还包括用于检测CYP2C9基因430、1075位点和VKORC1基因‑1639位点多态性的探针，其中，检测所述CYP2C9基因430位点多态性的探针序列为SEQ ID NO.12；检测所述CYP2C9基因1075位点多态性的探针序列为SEQ ID NO.13；检测所述VKORC1基因‑1639位点多态性的探针序列为SEQ ID NO.14。

【技术特征摘要】
1.一种检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物，其特征在于，包括用于检测CYP2C9基因430位点、1075位点和VKORC1基因-1639位点多态性的引物，其中，所述检测CYP2C9基因430位点多态性的引物包括序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的引物；所述CYP2C9基因1075位点多态性的引物包括序列如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的引物；所述VKORC1基因-1639位点多态性的引物包括序列如SEQIDNO7、SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所示的引物；所述组合物还包括用于检测CYP2C9基因430、1075位点和VKORC1基因-1639位点多态性的探针，其中，检测所述CYP2C9基因430位点多态性的探针序列为SEQIDNO.12；检测所述CYP2C9基因1075位点多态性的探针序列为SEQIDNO.13；检测所述VKORC1基因-1639位点多态性的探针序列为SEQIDNO.14。2.根据权利要求1所述的检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物，其特征在于，所述组合物还包括用于检测CYP2C9和VKORC1基因430位点、1075位点、-1639位点多态性的内标引物及内标探针，所述内标引物序列如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示，所述内标探针序列如SEQIDNO.15所示。3.一种检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-2任一项所述的组合物，所述试剂盒含有PCR检测试剂A和PCR检测试剂B，其中，所述PCR检测试剂A包含序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.15的多种引物和探针；所述PCR检测试剂B包含序列分别如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.15、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11的多种引物和探针。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样本溶解液，所述样本溶解液包含Tris-HCl缓冲液、十二烷基硫酸钠、EDTA、甘油和蛋白酶K。5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括野生型对照品、突变型对照品和空白对照品，其中，所述野生型对照品为包含有CYP2C9和VKORC1基因多态性位点430位点、1075位点、-1639位点的野生型重组质粒以及包含有内标基因的重组质粒的混合物；所述突变型对照品为包含有CYP2C9和VKO...

【专利技术属性】
技术研发人员：文荻琛，罗哲容，朱莎莎，李仁君，杨平，
申请(专利权)人：湖南健基生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43