本发明专利技术公开了脑脊液外泌体miRNA在MMD诊断和治疗中的应用，首次鉴定了来自MMD患者CSF的外泌体中表达改变的4种miRNA：miR‑574‑5p，miR‑3679‑5p，miR‑6165，miR‑6760‑5p，这4种miRNA的组合显示出良好的临床表现，AUC值为0.9203，灵敏度为81.25％，特异性为93.75％，用于预测MMD，因此表明在富集途径中存在对靶标的抑制。本发明专利技术将为MMD的准确诊断，为临床治疗MMD提供新靶标、新途径。
Application of cerebrospinal fluid exosome microRNA in the diagnosis and treatment of MD
【技术实现步骤摘要】
脑脊液外泌体miRNA在MMD诊断和治疗中的应用
本专利技术属于体外诊断领域，特别涉及脑脊液外泌体中miRNA在MMD诊断和治疗中的应用。
技术介绍
外泌体是脂质双层封闭的细胞外囊泡(大小为30-100nm)，通过蛋白质和微小RNA的递送充当细胞间通讯的介质。外泌体由大多数细胞释放，能够调节重要的中枢神经系统(CNS)过程，包括神经元发育，维持和再生。近年来，外泌体在神经病理学中的作用受到了极大的关注。研究表明，外泌体参与了神经炎症和血脑屏障的破坏。他们还参与了驻留脑细胞和旁邻细胞之间有毒蛋白质和失调miRNA的转移。此外，外泌体miRNA被保护免于RNase降解，并且可以在脑脊液中微量检测。鉴于外泌体在大脑通信和病理生理条件下的重要性，外泌体miRNA(exomiRs)已成为必不可少的诊断工具。Moyamoya病(又称MMD)是韩国、日本和中国等亚洲国家儿童和年轻人中风的重要原因。然而，MMD的发病机制尚不清楚。其特征在于患者颈内动脉狭窄，导致在脑底部形成模糊的血管网络。通常患者表现出不同的临床表现，这可归因于受影响的患者年龄变化，狭窄的程度和进展以及受影响的大脑皮层区域。在成年患者中，经常观察到颅内出血以及脑缺血，认知功能障碍，癫痫，不自主运动和头痛。MMD其中一种治疗方案是采用再血管化手术，旨在改善血流。但是成人患者容易发生术后并发症。由于疾病不可预料的复杂表现，诊断生物标志物的鉴定和对MMD病因学的认识已成为研究的重要领域。MMD的准确和早期诊断至关重要，因为诊断时的神经系统状态会影响长期结果。因此，本专利技术依赖于神经影像学技术，提供了有关大脑结构和生理学的信息，致力于研究具有高度敏感性和特异性的可靠生物标志物，可为MMD诊断，管理和咨询提供直接和互补的手段。烟雾病(MMD)是亚洲儿童和年轻人中风的重要原因。迄今为止，由于不同的临床表现和未知的发病机制，诊断仍然具有挑战性。该研究旨在鉴定脑脊液外泌体微小RNA，其可作为诊断和评估其临床应用的新型诊断生物标志物。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于提供脑脊液外泌体miRNA在MMD诊断和治疗中的应用。为达到上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：定量检测miR-574-5p、miR-3679-5p、miR6165和miR-6760-5pmiRNA表达量的试剂在制备诊断或辅助诊断MMD试剂盒中的应用。进一步的，所述定量检测miR-574-5p、miR-3679-5p、miR6165和miR-6760-5p表达量的试剂为定量检测miR-574-5p、miR-3679-5p、miR6165和miR-6760-5p表达量的引物。进一步的，所述定量检测miR-574-5p、miR-3679-5p、miR6165和miR-6760-5p表达量的引物核苷酸序列为：miR-574-5p正向引物：5’-TGAGTGTGTGTGTGTGAGTGTGT-3’；miR-3679-5p正向引物：5’-TGAGGATATGGCAGGGAAGGGGA-3’；has-miR-6165正向引物：5’-CAGCAGGAGGTGAGGGGAG-3’；has-miR-6760-5p正向引物：5’-CAGGGAGAAGGTGGAAGTGCAGA-3’。进一步的，所述的诊断或辅助诊断包括：1)确定所述样品中miR-574-5p、miR-3679-5p、miR6165和miR-6760-5p的表达水平；2)根据miR-574-5p、miR-3679-5p、miR6165和miR-6760-5p表达量差异确定是否为MMD。一种诊断或辅助诊断MMD的生物标志物，该生物标志物由miR-574-5p、miR-3679-5p、miR6165和miR-6760-5p组成。miR-574-5p、miR-3679-5p、miR6165和miR-6760-5p作为制备诊断或辅助诊断MMD标志物的应用。进一步的，所述的诊断或辅助诊断包括：1)确定所述样品中miR-574-5p、miR-3679-5p、miR6165和miR-6760-5p的表达水平；2)根据miR-574-5p、miR-3679-5p、miR6165和miR-6760-5p表达量差异确定是否为MMD。一种用于诊断或辅助诊断MMD的试剂盒，该试剂盒中含有定量miR-574-5p、miR-3679-5p、miR6165和miR-6760-5p表达量的试剂；所述诊断或辅助诊断包括：1)确定所述样品中miR-574-5p、miR-3679-5p、miR6165和miR-6760-5p的表达水平；2)根据miR-574-5p、miR-3679-5p、miR6165和miR-6760-5p表达量差异确定是否为MMD。进一步的，所述定量miR-574-5p、miR-3679-5p、miR6165和miR-6760-5p表达量的试剂核苷酸序列为：miR-574-5p正向引物：5’-TGAGTGTGTGTGTGTGAGTGTGT-3’；miR-3679-5p正向引物：5’-TGAGGATATGGCAGGGAAGGGGA-3’；has-miR-6165正向引物：5’-CAGCAGGAGGTGAGGGGAG-3’；has-miR-6760-5p正向引物：5’-CAGGGAGAAGGTGGAAGTGCAGA-3’。一种MMD药物治疗靶点，其为miR-574-5p、miR-3679-5p、miR6165和miR-6760-5p组合；miR-574-5p核苷酸序列为：UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU；miR-3679-5p核苷酸序列为：UGAGGAUAUGGCAGGGAAGGGGA；miR-6165核苷酸序列为：CAGCAGGAGGUGAGGGGAG；miR-6760-5p核苷酸序列为：CAGGGAGAAGGUGGAAGUGCAGA。本专利技术的有益效果是：目前尚未有任何关于脑脊液(CSF)的外泌体miRNA在诊断烟雾病的潜力报道。本专利技术在MMD患者中分析并发现了四种具有差异表达的CSF外泌体miRNA。此外，本专利技术使用生物信息学分析了CSF中差异表达的外泌体miRNA的有效性，并表明鉴定的miRNA可能在MMD的发病机理中起作用。这四种脑脊液miRNA可以填补MMD诊断的神经影像学，也可以深入了解脑脊液miRNA在MMD病理中的作用，有助于从理论上研究Moyamoya病(MMD)，并有望开发新型靶向药物，从而为Moyamoya提供新的治疗方向。附图说明图1为来自实验组(n＝15)和对照组(n＝15)个体的脑脊液(CSF)的microRNA(miRNA)微阵列表达数据的热图。miRNA表达在y轴上分层聚类，来自具有MMD个体(实验组)和不具有MMD个体(对照组)的CSF样品在x轴上分层聚类。右侧的图例表示相应行中表示的miRNA。根据右侧所示的色标描绘相对miRNA表达。红色表示上调和蓝色下调。图2为通过qRT-PCR验证不同的miRNA微阵列数据，微阵列组各包括16个患有MMD的个体(实验组)和16个不患有MMD的个体(对照组)。通过双尾Studentt检验计算P值。图2(1)～(5)图分别为miR-574-5p，miR-3679-5p，miR-6124，mi本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.定量检测miR‑574‑5p、miR‑3679‑5p、miR6165和miR‑6760‑5p miRNA表达量的试剂在制备诊断或辅助诊断MMD试剂盒中的应用。
【技术特征摘要】
1.定量检测miR-574-5p、miR-3679-5p、miR6165和miR-6760-5pmiRNA表达量的试剂在制备诊断或辅助诊断MMD试剂盒中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述定量检测miR-574-5p、miR-3679-5p、miR6165和miR-6760-5p表达量的试剂为定量检测miR-574-5p、miR-3679-5p、miR6165和miR-6760-5p表达量的引物。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述定量检测miR-574-5p、miR-3679-5p、miR6165和miR-6760-5p表达量的引物核苷酸序列为：miR-574-5p正向引物：5’-TGAGTGTGTGTGTGTGAGTGTGT-3’；miR-3679-5p正向引物：5’-TGAGGATATGGCAGGGAAGGGGA-3’；has-miR-6165正向引物：5’-CAGCAGGAGGTGAGGGGAG-3’；has-miR-6760-5p正向引物：5’-CAGGGAGAAGGTGGAAGTGCAGA-3’。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诊断或辅助诊断包括：1)确定所述样品中miR-574-5p、miR-3679-5p、miR6165和miR-6760-5p的表达水平；2)根据miR-574-5p、miR-3679-5p、miR6165和miR-6760-5p表达量差异确定是否为MMD。5.一种诊断或辅助诊断MMD的生物标志物，其特征在于，该生物标志物由miR-574-5p、miR-3679-5p、miR6165和miR-6760-5p组成。6.miR-574-5p、miR-3679-5p、miR6165和miR-6760-5p作为制备诊断或辅助诊断MMD标志物的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的诊断或辅助诊断包括：1)确定所述样品中m...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕晓明，王刚，陈佑明，黄敬，
申请(专利权)人：南方医科大学第三附属医院广东省骨科研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44
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