单一向导RNA、CRISPR/CAS9系统及其使用方法技术方案

本公开内容涉及单一向导RNA(sgRNA)，规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)系统，及其用于预防、改善或治疗角膜营养不良的方法。

Single Guided RNA, CRISPR/CAS9 System and Its Application

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】单一向导RNA、CRISPR/CAS9系统及其使用方法
本公开内容涉及单一向导RNA(sgRNA)，规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)系统，及其用于预防、改善或治疗角膜营养不良的方法。
技术介绍
大多数角膜营养不良以常染色体显性方式遗传，具有显性-负性病理机制。对于某些基因，例如TGFBI和KRT12，已经表明它们是单倍体足够(haplosufficient)的；意味着基因的一个功能性拷贝足以维持正常功能。通过使用特异性靶向突变等位基因的siRNA，可以克服突变蛋白的显性负性作用并且在体外恢复细胞的正常功能。尽管siRNA的作用是短暂的，但只要siRNA在细胞中以足够高的浓度存在就会持续；CRISPR/Cas9基因编辑提供了永久修饰突变等位基因的机会。用于催化切割双链DNA的简单内源性细菌系统的发现彻底改变了治疗性基因编辑领域。II型规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)是一种可设计的RNA引导内切核酸酶，最近已被证明可有效用于哺乳动物细胞的基因编辑(HsuPD，LanderES，ZhangF.D本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种针对用于预防、改善或治疗角膜营养不良的CRISPR/Cas9系统设计的单一向导RNA(sgRNA)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.20 US 62/377,586;2017.02.23 US 62/462,808;1.一种针对用于预防、改善或治疗角膜营养不良的CRISPR/Cas9系统设计的单一向导RNA(sgRNA)。2.根据权利要求1所述的sgRNA，包含(i)具有选自SEQIDNO:(10+4n)或SEQIDNO:(11+4n)的核苷酸序列的CRISPR靶向RNA(crRNA)序列，其中n为0至221的整数，和(ii)反式激活crRNA(tracrRNA)序列，其中所述crRNA序列和所述tracrRNA序列不是天然一起出现的。3.根据权利要求2所述的sgRNA，其中所述tracrRNA包含与SEQIDNO:2或6的核苷酸序列具有至少85％序列同一性的核苷酸序列。4.一种设计用于CRISPR/Cas9系统的sgRNA对，所述sgRNA对包含：(i)第一sgRNA，其包含(a)用于顺式位于引起疾病的突变或SNP的3'-端侧的产生第一原型间隔区相邻基序(PAM)的突变或单核苷酸多态性(SNP)的第一crRNA序列，(b)tracrRNA序列，其中所述第一crRNA序列和所述tracrRNA序列不是天然一起出现的；(ii)第二sgRNA，其包含(a)用于顺式在引起疾病的突变或SNP的5'-端侧的产生第二PAM的突变或SNP的第二crRNA向导序列；(b)tracrRNA序列，其中所述第二crRNA序列和所述tracrRNA序列不是天然一起出现的。5.根据权利要求4所述的sgRNA对，其中所述CRISPR/Cas9系统用于预防、改善或治疗角膜营养不良。6.根据权利要求4或5所述的sgRNA对，其中所述产生PAM的突变或SNP位于TGFBI基因中。7.根据权利要求4至6中任一项所述的sgRNA对，其中所述产生PAM的突变或SNP位于TGFBI基因的内含子中。8.根据权利要求4至7中任一项所述的sgRNA对，其中所述第一crRNA序列和所述第二crRNA序列中的至少一种包含选自图19至图35所列序列的核苷酸序列；和/或所述第一crRNA序列和所述第二crRNA序列中的至少一种包含选自表2所列序列的核苷酸序列。9.一种工程化的规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)系统，其包含(i)至少一种载体，其包含编码Cas9核酸酶的核苷酸分子和根据权利要求1至3任一项所述的sgRNA，或者(ii)至少一种载体，其包含编码Cas9核酸酶的核苷酸分子和根据权利要求4至8中任一项所述的sgRNA对，其中所述载体中的Cas9核酸酶和所述sgRNA对不是天然一起出现的。10.根据权利要求9所述的工程化CRISPR/Cas9系统，其中所述Cas9核酸酶来自链球菌、葡萄球菌或其变体。11.根据权利要求9至10中任一项所述的工程化CRISPR/Cas9系统，其中所述Cas9核酸酶包含与选自SEQIDNO:4或8的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。12.根据权利要求9至11中任一项所述的工程化CRISPR/Cas9系统，其中所述编码Cas9核酸酶的核苷酸分子包含与选自SEQIDNO:3或7的核苷酸序列具有至少85％序列同一性的核苷酸序列。13.根据权利要求9至12中任一项所述的工程化CRISPR/Cas9系统，其还包含修复核苷酸分子。14.根据权利要求9至13中任一项所述的工程化CRISPR/Cas9系统，其还包含一种或更多种核定位信号(NLS)。15.根据权利要求9至14中任一项所述的工程化CRISPR/Cas9系统，其中所述sgRNA和所述Cas9核酸酶包含在同一载体内。16.改变基因产物表达的方法，包括：将根据权利要求9至15中任一项所述的工程化CRISPR/Cas9系统引入含有并表达具有靶序列和编码所述基因产物的DNA分子的细胞中。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述工程化CRISPR/Cas9系统包含：(a)与同所述靶序列杂交的所述sgRNA可操作连接的第一调节元件，和(b)与编码Cas9核酸酶的核苷酸分子可操作连接的第二调节元件，其中所述sgRNA靶向所述靶序列，且所述Cas9核酸酶切割所述DNA分子。18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述细胞为真核细胞。19.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞或人细胞。20.在受试者中预防、改善或治疗与突变或单核苷酸多态性(SNP)相关的疾病的方法，包括根据权利要求16至19中任一项所述，改变所述受试者的基因产物表达，其中DNA分子包含突变序列。21.在受试者中预防、改善或治疗与基因突变或单核苷酸多态性(SNP)相关的角膜营养不良的方法，包括：向所述受试者施用包含至少一种载体的工程化CRISPR/Cas9系统，所述载体包含：(i)编码Cas9核酸酶的核苷酸分子，和(ii)CRISPR靶向RNA(crRNA)序列，其与同靶序列互补的核苷酸序列杂交，所述靶序列与原型间隔区相邻基序(PAM)的5'-端相邻，其中所述靶序列或所述PAM包含引起所述角膜营养不良的突变或SNP，其中所述编码Cas9核酸酶的核苷酸分子和所述crRNA序列不是天然一起出现的。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述PAM包含所述突变或SNP。23.根据权利要求21至22中任一项所述的方法，所述crRNA序列包含所述靶序列，且所述crRNA序列的长度为17至24个核苷酸。24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中所述crRNA序列由选自SEQIDNO:(10+4n)的核苷酸序列组成，其中n为0至221的整数。25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其中所述PAM和所述Cas9核酸酶来自链球菌或葡萄球菌。26.根据权利要求21至25中任一项所述的方法，其中所述PAM由NGG或NNGRRT组成，其中N为A、T、G和C中的任一种，且R为A或G。27.根据权利要求21至26中任一项所述的方法，其中施用包括将所述工程化CRISPR/Cas9系统引入所述受试者的角膜中。28.根据权利要求21至27中任一项所述的方法，其中施用包括将所述工程化CRISPR/Cas9系统注射到所述受试者的角膜中。29.根据权利要求21至28中任一项所述的方法，其中施用包括将所述工程化CRISPR/Cas9系统引入含有并表达具有所述靶序列的DNA分子的细胞中。30.根据权利要求21至29中任一项所述的方法，其中所述角膜营养不良选自上皮基底膜营养不良(EBMD)、Meesmann角膜营养不良(MECD)、Thiel-Behnke角膜营养不良(TBCD)、网格状角膜营养不良(LCD)、颗粒状角膜营养不良(GCD)和Schnyder角膜营养不良(SCD)。31.根据权利要求21至30中任一项所述的方法，其中所述SNP位于选自TGFBI、KRT3、KRT12、GSN和UBIAD1的基因中。32.根据权利要求21至31中任一项所述的方法，其中包含所述基因突变或SNP的突变序列编码选自以下的突变蛋白：(i)包含Leu509Arg、Arg666Ser、Gly623Asp、Arg555Gln、Arg124Cys、Val505Asp、Ile522Asn、Leu569Arg、His572Arg、Arg496Trp、Pro501Thr、Arg514Pro、Phe515Leu、Leu518Pro、Leu518Arg、Leu527Arg、Thr538Pro、Thr538Arg、Val539Asp、Phe540del、Phe540Ser、Asn544Ser、Ala546Thr、Ala546Asp、Phe547Ser、Pro551Gln、Leu558Pro、His572del、Gly594Val、Val613del、Val613Gly、Met619Lys、Ala620Asp、Asn622His、Asn622Lys、Asn622Lys、Gly623Arg、Gly623Asp、Val624_Val625del、Val624Met、Val625Asp、His626Arg、His626Pro、Val627SerfsX44、Thr629_Asn630insAsnValPro、Val631Asp、Arg666Ser、Arg555Trp、Arg124Ser、Asp123delins、Arg124His、Arg124Leu、Leu509Pro、Leu103_Ser104del、Val113Ile、Asp123His、Arg124Leu和/或Thr125_Glu126del的突变TGFBI蛋白；(ii)具有Glu498Val、Arg503Pro和/或Glu509Lys的突变KRT3蛋白；(iii)具有Met129Thr、Met129Val、Gln130Pro、Leu132Pro、Leu132Va、Leu132His、As...

【专利技术属性】
技术研发人员：T摩尔，A内斯比特，D考特尼，K克里斯蒂，G李，
申请(专利权)人：阿维利诺美国实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US