本发明专利技术公开了一种原料乳及牛奶中植物源性蛋白成分鉴别方法，其特征在于：包括以下步骤：一、DNA提取，设计识别植物源性成分的特异性的引物和荧光探针，提取样品基因组DNA，利用实时荧光定量PCR的方法进行鉴别判定，所述特异性的引物的序列为：上游引物5｀-GGATTGAGCCTTGGTATGGA-3｀；下游引物5｀-TTTCGGAAAACAGGATTTGG-3｀；所述探针序列为：荧光探针5｀-CAAATTCAGAGAAACCCTGGA-3｀；二、荧光定量PCR检测。本发明专利技术的有益效果是：以植物叶绿体基因保守区域片段为检测目标，设计出特异的引物和荧光探针，建立起来的荧光定量PCR鉴别方法，该种鉴别方法灵敏度强、特异性高、快速简单。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种蛋白成分鉴别方法，尤其涉及。
技术介绍
乳制品是人民大众日常饮食中必不可少的组成部分。在利益的驱使下，原料乳、牛奶等乳制品掺假行为屡禁不止。随着行业潜规则的不断曝光以及检测水平的逐渐提高，乳制品掺假的手段也不断提高，从最初的掺水、尿素、淀粉、碳酸铵、三聚氰胺行为，到目前在产品中添加一些低廉的大豆蛋白、小麦蛋白等植物蛋白或蛋白水解物相对“高明”的方法，可以说，采用传统蛋白质检测方法越来越难以有效判别出原料乳及牛奶产品的质量。 因此，为解决上述问题，特提供一种新的技术方案来满足需求。
技术实现思路
本专利技术提供一种快速、准确的鉴别原料乳及牛奶中掺入植物源蛋白的荧光定量PCR鉴别方法。本专利技术采用的技术方案是: ，包括以下步骤: 一、DNA提取 设计识别植物源性成分的特异性的引物和荧光探针，提取样品基因组DNA，利用实时荧光定量PCR的方法进行鉴别判定， 所述特异性的引物的序列为: 上游引物 5 ' -GGATTGAGCCTTGGTATGGA-3 ' ； 下游引物 5 ' -TTTCGGAAAACAGGATTTGG-3 ' ； 所述探针序列为: 荧光探针 5 ' -CAAATTCAGAGAAACCCTGGA-3 ' ； 二、荧光定量PCR检测: 采用荧光定量PCR反应体系总量为19.3-29.8 μ L，体系组成包括为荧光定量PCR反应液12-13yL，浓度为IOymol的上游引物0.5_1.5yL，浓度为IOymol的下游引物0.5-1.5 μ L，浓度为 10 μ mo I 的探针 0.3-0.8 μ L,模板 DNA1-3 μ L, ddH205_10 μ L,扩增程序为:将荧光定量PCR反应体系中的各试剂加入到荧光定量八联管，同时设立阴性对照管和阳性对照，置于实时荧光定量PCR仪，将控制温度在94-96°C对荧光定量PCR反应体系进行变性处理1-2 min，保持温度在94-96°C变性处理5_10s，然后降低温度至55_60°C进行退火处理25-35s，退火完毕后，升高温度至72°C进行延伸处理25_50s，将上述的变性处理-退火处理-延伸处理三个步骤按上述的顺序和工艺要求重复35-45个循环，根据不同荧光探针标记在55-60 °C结束开始收集荧光信号。所述荧光探针5 '端为 FAM、HEX、ROX、JOE、FAM、SYBR Green 1、TET、Cy3、Cy5或VIC荧光物质标记，所述荧光探针3 ’端可以连接TAMRA或BHQ荧光淬灭剂。所述植物源成分为大豆、小麦、水稻或玉米。本专利技术的有益效果是:以植物叶绿体基因保守区域片段为检测目标，设计出特异的引物和荧光探针，建立起来的荧光定量PCR鉴别方法，该种鉴别方法比普通的PCR鉴别方法的准确率高，区分方法快速简单，因为多了探针，所以荧光定量PCR比普通的PCR灵敏度强、特异性高。【附图说明】下面结合附图和【具体实施方式】对本专利技术作进一步详细描述。图1荧光定量PCR扩增结果示意图。图2人工样品I (含大豆蛋白样品)结果示意图，其中:人工样品I为含有大豆分离蛋白的原料乳，阳性对照为大豆基因组DNA提取液，阴性对照为天然牛乳基因组DNA提取液。图3人工样品2 (含小麦蛋白粗提液样品)结果示意图，其中:人工样品II为含有小麦蛋白粗提液的原料乳，阳性对照为小麦DNA提取液，阴性对照为牛天然牛乳基因组DNA提取液。【具体实施方式】为了加深对本专利技术的理解，下面将结合实施例和附图对本专利技术作进一步详述，该实施例仅用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术保护范围的限定。实施例1` ，包括以下步骤: 一、DNA提取 设计识别大豆成分的特异性的引物和荧光探针，提取大豆基因组DNA，利用实时荧光定量PCR的方法进行鉴别判定， 所述特异性的引物的序列为: 上游引物 5 ' -GGATTGAGCCTTGGTATGGA-3 ' ； 下游引物 5 ' -TTTCGGAAAACAGGATTTGG-3 ' ； 所述探针序列为: 荧光探针 5 ' -CAAATTCAGAGAAACCCTGGA-3 ' ； 二、荧光定量PCR检测: 采用荧光定量PCR反应体系总量为19.3 μ L，体系组成包括为荧光定量PCR反应液12 μ L,浓度为10 μ mo I的上游引物0.5 μ L,浓度为10 μ mo I的下游引物0.5 μ L,浓度为10 μ mo I的探针0.3 μ L，模板DNAl μ L，ddH205 μ L，扩增程序为:将荧光定量PCR反应体系中的各试剂加入到荧光定量八联管，设立待测样品组(模板为待测大豆提取的DNA溶液)，同时设立阴性对照管(模板替换为牛基因组DNA)，阳性对照(模板替换为大豆基因组DNA)，置于实时荧光定量PCR仪，将控制温度在96°C对荧光定量PCR反应体系进行变性处理lmin，保持温度在96°C变性处理10s，然后降低温度至55°C进行退火处理25s，退火完毕后，升高温度至72°C进行延伸处理25s，将上述的变性处理-退火处理-延伸处理三个步骤按上述的顺序和工艺要求重复35个循环，根据荧光探针5 I示记的ROX的情况，3 '端连接BHQ，在55°C结束开始收集ROX荧光信号。实施例2 ，包括以下步骤: 一、DNA提取 设计识别小麦成分的特异性的引物和荧光探针，提取小麦基因组DNA，利用实时荧光定量PCR的方法进行鉴别判定， 所述特异性的引物的序列为: 上游引物 5 ' -GGATTGAGCCTTGGTATGGA-3 ' ； 下游引物 5 ' -TTTCGGAAAACAGGATTTGG-3 ' ； 所述探针序列为: 荧光探针 5 ' -CAAATTCAGAGAAACCCTGGA-3 ' ； 二、荧光定量PCR检测: 采用荧光定量PCR反应体系总量为25 μ L，体系组成包括为荧光定量PCR反应液12.5 μ L,浓度为IOymol的上游引物IuL,浓度为IOymol的下游引物IyL,浓度为10 μ mo I的探针0.5 μ L，模板DNA2 μ L，ddH208 μ L，扩增程序为:将荧光定量PCR反应体系中的各试剂加入到荧光定量八联管，设立待测样品组(模板为待测小麦提取的DNA溶液)，同时设立阴性对照管(模板替换为牛基因组DNA)，阳性对照(模板替换为小麦基因组DNA)，置于实时荧光定量PCR仪，将控制温度在95°C对荧光定量PCR反应体系进行变性处理1.5min,保持温度在95°C变性处理5s，然后降低温度至58°C进行退火处理30s，退火完毕后，升高温度至72°C进行延伸处理30s，将上述的变性处理-退火处理-延伸处理三个步骤按上述的顺序和工艺要求重复40个循环，根据荧光探针5 I示记的HEX的情况，3 '端连接TAMRA，在58°C结束开始收集HEX荧光信号。实施例3 ，包括以下步骤: 一、DNA提取 设计识别水稻成分的特异性的引物和荧光探针，提取水稻基因组DNA，利用实时荧光定量PCR的方法进行鉴别判定， 所述特异性的引物的序列为: 上游引物 5 ' -GGATTGAGCCTTGGTATGGA-3 ' ； 下游引物 5 ' -TTTCG本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种原料乳及牛奶中植物源性蛋白成分鉴别方法，其特征在于：包括以下步骤：一、DNA提取设计识别植物源性成分的特异性的引物和荧光探针，提取样品基因组DNA，利用实时荧光定量PCR的方法进行鉴别判定，所述特异性的引物的序列为：上游引物5｀?GGATTGAGCCTTGGTATGGA?3｀；下游引物5｀?TTTCGGAAAACAGGATTTGG?3｀；所述探针序列为：荧光探针5｀?CAAATTCAGAGAAACCCTGGA?3｀；二、荧光定量PCR检测采用荧光定量PCR反应体系总量为19.3?29.8μL，体系组成包括为荧光定量PCR反应液12?13μL，浓度为10μmol的上游引物0.5?1.5μL，浓度为10μmol的下游引物0.5?1.5μL，浓度为10μmol的探针0.3?0.8μL，模板DNA1?3μL，ddH2O5?10μL，扩增程序为：将荧光定量PCR反应体系中的各试剂加入到荧光定量八联管，同时设立阴性对照管和阳性对照，置于实时荧光定量PCR仪，将控制温度在94?96℃对荧光定量PCR反应体系进行变性处理1?2?min，保持温度在94?96℃变性处理5?10s,?然后降低温度至55?60℃进行退火处理25?35s,退火完毕后，升高温度至72℃进行延伸处理25?50s，将上述的变性处理?退火处理?延伸处理三个步骤按上述的顺序和工艺要求重复35?45个循环,根据不同荧光探针标记在55?60℃结束开始收集荧光信号。...
【技术特征摘要】
1.一种原料乳及牛奶中植物源性蛋白成分鉴别方法，其特征在于:包括以下步骤: 一、DNA提取 设计识别植物源性成分的特异性的引物和荧光探针，提取样品基因组DNA，利用实时荧光定量PCR的方法进行鉴别判定， 所述特异性的引物的序列为: 上游引物 5 ' -GGATTGAGCCTTGGTATGGA-3 ' ； 下游引物 5 ' -TTTCGGAAAACAGGATTTGG-3 ' ； 所述探针序列为: 荧光探针 5 ' -CAAATTCAGAGAAACCCTGGA-3 ' ； 二、荧光定量PCR检测 采用荧光定量PCR反应体系总量为19.3-29.8 μ L，体系组成包括为荧光定量PCR反应液12-13yL，浓度为IOymol的上游引物0.5_1.5yL，浓度为IOymol的下游引物.0.5-1.5 μ L，浓度为 10 μ mo I 的探针 0.3-0.8 μ L,模板 DNA1-3 μ L, ddH205_10 μ L,扩增程序为:将荧光定量P...
【专利技术属性】
技术研发人员：邵彪，黄伟东，陈刚，丁红梅，季葛振，王振涛，
申请(专利权)人：南通市产品质量监督检验所，
类型：发明
国别省市：
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