本发明专利技术公开了生物检测领域内的一种检测猪基因组拷贝数变异的PCR试剂盒，所述试剂盒包括2×SYBRGreenqPCRMix试剂、如SEQIDNO.1所示的目标序列正向引物、如SEQIDNO.2所示的目标序列反向引物、如SEQIDNO.3所示的参考序列正向引物、如SEQIDNO.4所示的参考序列反向引物、如SEQIDNO.5所示的参考序列、去离子水、无拷贝数变异的对照样本，本发明专利技术提供的对CNVs的检测不受猪年龄、性别等限制，检测方法简单易操作、准确，可用于猪基因组CNVs的检测。
【技术实现步骤摘要】
—种检测猪基因组拷贝数变异的PCR试剂盒及检测方法
本专利技术涉及一种PCR试剂盒，特别涉及一种检测猪基因组拷贝数变异检测方法。
技术介绍
自20世纪80年代以来，由于生物技术的发展，特别是人类基因组计划的起动(1991)，基因组DNA序列的遗传变异即分子多态性，被大量开发出来。除了限制性片段长度多态性(RFLP)、单核苷酸多态性(SNPs)、微卫星(Microsatellite)等这些常规的遗传标记外，新近在人类基因组中又发现了另外一类丰富的多态性来源一拷贝数变异(Copy numbervariations, CNVs)。CNVs是指基因组中与参考序列相比>lkb的DNA片段插入、缺失和/或扩增，及其相互组合衍生出的复杂染色体结构变异。相邻的、部分重叠的CNVs合并在一起成为一个更大的基因组片段成为拷贝数变异区间(Copy Number Variation Region,CNVR)。拷贝数变异具有基因组覆盖范围广(人类基因组上CNVs覆盖率约13%)、突变率高、分布于基因组特定位置、可遗传及相对稳定的特点。目前，实时荧光定量PCR (qPCR)技术是一种常用的CNVs检测技术。在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green荧光染料，SYBR Green荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入DNA链中的SYBR分子不发射荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，进而通过检测荧光信号的强度来反映基因组DNA的数量。通过对检测样本的目的基因(具有拷贝数多态)及参考基因(无拷贝数多态，只有2个拷贝)进行相对定量，比较这两个检测值的比值估计检测样本候选基因的拷贝数。该方法具有简单易操作、成本低的优势，可以检测目的片段的绝对拷贝数，但不适于大样本的高通量检测。猪作为一种重要的经济动物和人类医学研究的模式动物，它的一些重要的经济性状如繁殖、生长、肉质、抗病等备受研究者们关注。因此，对猪基因组CNVs的检测，不仅有利于了解CNVs这一遗传变异对猪基因组的影响，而且为开展CNVs与经济性状和疾病表型之间的关联分析研究提供技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目标是提供一种检测猪基因组拷贝数变异的PCR试剂盒及检测方法，对CNVs的检测不受猪年龄、性别等限制，检测方法简单易操作、准确。本专利技术的目标是这样实现的:一种检测猪基因组拷贝数变异的PCR试剂盒及检测方法， 所述试剂盒包括2XSYBR Green qPCR Mix试剂、如SEQ ID N0.1所示的目标序列正向引物、如SEQ ID N0.2所示的目标序列反向引物、如SEQ ID N0.3所示的参考序列正向引物、如SEQ ID N0.4所示的参考序列反向引物、如SEQ ID N0.5所示的参考序列、去离子水、无拷贝数变异的对照样本； 作为本专利技术的进一步限定，目标序列如SEQ ID N0.6所示。所述检测方法包括以下步骤:1)提取猪的基因组DNA； 2)以上述猪基因组DNA为模板，利用序列为SEQID N0.1的目标序列正向引物、序列为SEQ ID N0.2的目标序列反向引物以及序列为SEQ ID N0.3的参考序列正向引物、序列为SEQ ID N0.4的参考序列反向引物通过实时荧光定量PCR反应扩增出试验组目标序列和试验组参考序列； 3)以对照样本为模板，利用序列为SEQID N0.1的目标序列正向引物、序列为SEQ IDN0.2的目标序列反向引物以及序列为SEQ ID N0.3的参考序列正向引物、序列为SEQ IDN0.4的参考序列反向引物通过实时荧光定量PCR反应扩增出对照组目标序列和对照组参考序列； 3)根据上述实时荧光定量PCR荧光值，以参考序列为标准，推断目标序列的拷贝数。作为本专利技术的进一步限定，所述步骤2)中实时荧光定量PCR反应使用的扩增体系以20 μ I计为: 50ng/ μ I 模板 DNAI μ I, 2X SYBR Green qPCR Mix 10 μ I, lOpmol/μΙ 引物 FI μ I, lOpmol/μΙ 引物 RI μ I, 去离子水7 μ I。作为本专利技术的进一步限定，所述步骤2)中实时荧光定量PCR反应条件为: a)预变性: 95 0C 5分钟； b)扩增反应: 变性:95°C 10秒， 退火:60°C 10秒， 延伸:72°C 10秒， 45个循环； 72 0C 10 分钟； c)绘制溶解曲线:950C 5 秒， 65 0C I分钟，97 0C 10 秒。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于:本专利技术提供的对CNVs的检测不受猪年龄、性别等限制；并且检测方法简单易操作、准确。【附图说明】图1为qPCR时绘制的扩增曲线。图2为qPCR时绘制的标准曲线。图3为qPCR时引物的溶解曲线。【具体实施方式】用以下实例对本专利技术做进一步解释，但不限定本专利技术的范围，若无特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1为本专利技术的检测方法，步骤如下: 1.1猪耳组织基因组DNA提取 本试验采用QIAGEN血液与组织DNA提取试剂盒，从猪耳组织中提取基因组DNA，具体方法如下: 1)取小于25mg的耳组织置于2ml的离心管中，用手术剪刀充分剪碎； 2)加入180μ I BufferATL及20μ I蛋白酶K，漩涡混匀，56°C消化2-4小时(每隔0.5小时混匀一次)至组织块消化完全； 3)加入200 μ I BufferAL，漩涡混匀，56°C消化 IOmin ； 4)加入200μ I无水乙醇,镟涡混匀； 5)将消化液倒入吸附柱中，置于2ml离心管，8000rpm离心Imin； 6)取出吸附柱并置于新的2ml离心管,加入500μ I BufferAWl, 8000rpm离心Imin ； 7)取出吸附柱并置于新的2ml离心管,加入500μ I BufferAW2,14000rpm离心3min ; 8)将吸附柱转移到新的2ml离心管中，加入100μ I BufferAE，室温放置5_10min，8000rpm 离心 Imin ； 9)基因组DNA存在于离心管中溶液中，4°C保存备用或_20°C长期保存。`1.2目标序列及参考序列的扩增 本专利技术中的参考序列为已知的不存在拷贝数变异的序列，即胰高血糖素基因(Glucagon, GCG)中的一段147bp的序列，如SEQ ID N0.5所示。正反向扩增通用引物分别为:如 SEQ ID N0.3 所示的 F5’ -GAATCAACACCATCGGTCAAAT-3’ 和如 SEQ ID N0.4 所示的R5’-CTCCACCCATAGAATGCCCAGT-3’ 。目标序列为一段164bp的序列，如SEQ ID N0.6所示，正反向目标引物为:如 SEQ ID N0.1 所示的 F5’ -TTGGGAAATGTTCAACTGTGTA -3’ 和如 SEQ ID N0.2 所示的R5，-TCAATGGAATGAGGTAGGGTCT -3，。目标序列和参考序列的实时荧光定量PCR反应体系一样，均以20 μ I计为: 50ng/本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测猪基因组拷贝数变异的PCR试剂盒，其特征在于，包括2×SYBR?Green?qPCR?Mix试剂、如SEQ?ID?NO.1所示的目标序列正向引物、如SEQ?ID?NO.2所示的目标序列反向引物、如SEQ?ID?NO.3所示的参考序列正向引物、如SEQ?ID?NO.4所示的参考序列反向引物、如SEQ?ID?NO.5所示的参考序列、去离子水、无拷贝数变异的对照样本。
【技术特征摘要】
1.一种检测猪基因组拷贝数变异的PCR试剂盒，其特征在于，包括2XSYBR Green qPCRMix试剂、如SEQ ID N0.1所示的目标序列正向引物、如SEQ ID N0.2所示的目标序列反向引物、如SEQ ID N0.3所示的参考序列正向引物、如SEQ ID N0.4所示的参考序列反向引物、如SEQ ID N0.5所示的参考序列、去离子水、无拷贝数变异的对照样本。2.根据权利要求1所述的一种检测猪基因组拷贝数变异的PCR试剂盒，其特征在于，目标序列如SEQ ID N0.6所示。3.一种使用权利要求1或2所述的PCR试剂盒检测猪基因组拷贝数变异的检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)提取猪的基因组DNA；2)以上述猪基因组DNA为模板，利用序列为SEQID N0.1的目标序列正向引物、序列为SEQ ID N0.2的目标序列反向引物以及序列为SEQ ID N0.3的参考序列正向引物、序列为SEQ ID N0.4的参考序列反向引物通过实时荧光定量PCR反应扩增出试验组目标序列和试验组参考序列； 3)以对照样本为模板，利用序列为SEQID N0.1的目标序列正向引物、序列为SEQ IDN0.2的目标序...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘剑锋，程洪青，王海飞，
申请(专利权)人：扬州创日畜牧科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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