一种基于PCR-LDR技术的检测拷贝数变异的方法技术

本发明专利技术涉及基于通用荧光引物的多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，包括下列步骤：（1）提供多重竞争性PCR引物，由至少一对待测区段引物和至少一对参照区段引物组成；（2）提供竞争性内对照模板，内对照模板序列与实际序列在序列中仅有一个碱基替换；（3）多重竞争性PCR反应；（4）LDR反应；和（5）数据分析。本发明专利技术还提供基于以上检测方法的试剂盒，适用于5~25个基因/反应的拷贝数变异的检测，是一种快速、中通量、经济的拷贝数变异检测方案。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及基于多重竞争性PCR以及LDR技术检测拷贝数变异的方法，应用于生物科学研究与临床分子诊断。
技术介绍
拷贝数变异(copy number variations, CNVs)是近年来发现的基因组多样性的新形式，它是指与参考序列相比，基因组中lkb 3Mb的DNA片段的结构变异现象。CNVs广泛存于基因组中，与一些遗传性疾病的发生相关，对人类抗病性和易感性表型等变异有重要影响。这就要求建立一种快速、准确和低成本的CNVs分型检测技术。随着生物技术的发展，不同的研究小组相继开发了许多的检测方法，主要包括以杂交为基础和以PCR为基础的检测技术。前者可以在全基因组水平上对CNVs进行检测，代表技术有微阵列比较基因杂交(SolinasToldo, Lampel et al Genes Chromosomes Cancer. 1997Dec; 20 (4) : 399-407)、全基因组 SNP 芯片(Irving, Bloodworth et al. Cancer Res. 2005Aprl5; 65 (8) : 3053-8)、代表性寡核昔酸微阵列技术(L本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多重竞争性PCR和LDR联合检测拷贝数变异的方法，包括以下步骤：（1）提供多重竞争性PCR引物：所述的多重竞争性PCR引物由分别针对待测区段和参照区段设计的至少一对待测区段引物和至少一对参照区段引物组成，TM值≥62℃，长度范围为18~50bp，所述多重竞争性PCR引物所产生的不同扩增产物片段间的长度差异没有要求；（2）提供内对照序列：通过全基因合成法合成一条与所述多重竞争性PCR的扩增产物片段之一相比仅一个替换碱基的差异的序列，且所述替换碱基的位置不在引物结合区；或者通过载体克隆法将PCR产物克隆到质粒上，并在某个碱基上导入替换突变，且所述替换突变的碱基的位置不在引物结合区；（3）多重竞...

【技术特征摘要】
1. 一种多重竞争性PCR和LDR联合检测拷贝数变异的方法，包括以下步骤 (1)提供多重竞争性PCR引物所述的多重竞争性PCR引物由分别针对待测区段和参照区段设计的至少一对待测区段引物和至少一对参照区段引物组成，TM值> 62°C，长度范围为18飞Obp，所述多重竞争性PCR引物所产生的不同扩增产物片段间的长度差异没有要求； (2)提供内对照序列通过全基因合成法合成一条与所述多重竞争性PCR的扩增产物片段之一相比仅一个替换碱基的差异的序列，且所述替换碱基的位置不在引物结合区；或者通过载体克隆法将PCR产物克隆到质粒上，并在某个碱基上导入替换突变，且所述替换突变的碱基的位置不在引物结合区； (3)多重竞争性PCR反应将含待测区段和参照区段的待测样本和对照样本分别与所述内对照的稀释液混合在一起，所述待测样本和所述对照样本的DNA分子数分别与所述内对照稀释液的DNA分子数相差10倍范围内，进行多重竞争性PCR反应； (4)多重LDR测序反应取所述多重竞争性PCR反应的产物与含所述测序探针的LDR反应体系混合,进行LDR测序反应； (5)LDR测序产物电泳分离对所述LDR测序反应的产物进行电泳分离，利用LDR测序反应将单碱基差异转变成序列长度差异的原理将所述待测样本或所述对照样本分别与内对照产物区分开、且利用LDR测序产物的浓度和模板浓度成线性关系的原理，通过检测LDR测序产物在电泳分离后的浓度分别获得所述待测样本、所述对照样本、和所述内对照所对应的各个模板的相对浓度，所述的相对浓度以电泳分离片段的峰高和/或峰面积表示； (6)数据分析 1.将每个待测区段和参照区段的峰高和/或峰面积(S)和内对照的峰高和/或峰面积(I)作比，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆炯，肖君华，陈轶群，
申请(专利权)人：上海翼和应用生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：