本发明专利技术涉及基于通用荧光引物的多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，包括下列步骤：（1）提供多重竞争性PCR引物，由至少一对待测区段引物和至少一对参照区段引物组成；（2）提供竞争性内对照模板，内对照模板序列与实际序列在序列中仅有一个碱基替换；（3）多重竞争性PCR反应；（4）LDR反应；和（5）数据分析。本发明专利技术还提供基于以上检测方法的试剂盒，适用于5~25个基因/反应的拷贝数变异的检测，是一种快速、中通量、经济的拷贝数变异检测方案。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及基于多重竞争性PCR以及LDR技术检测拷贝数变异的方法，应用于生物科学研究与临床分子诊断。
技术介绍
拷贝数变异(copy number variations, CNVs)是近年来发现的基因组多样性的新形式，它是指与参考序列相比，基因组中lkb 3Mb的DNA片段的结构变异现象。CNVs广泛存于基因组中，与一些遗传性疾病的发生相关，对人类抗病性和易感性表型等变异有重要影响。这就要求建立一种快速、准确和低成本的CNVs分型检测技术。随着生物技术的发展，不同的研究小组相继开发了许多的检测方法，主要包括以杂交为基础和以PCR为基础的检测技术。前者可以在全基因组水平上对CNVs进行检测，代表技术有微阵列比较基因杂交(SolinasToldo, Lampel et al Genes Chromosomes Cancer. 1997Dec; 20 (4) : 399-407)、全基因组 SNP 芯片(Irving, Bloodworth et al. Cancer Res. 2005Aprl5; 65 (8) : 3053-8)、代表性寡核昔酸微阵列技术(Lucito, Healy et al. Genome Res. 20030ct; 13 (10) :2291-305. Epub2003Sepl5.)等，其优点是通量高且易于实现自动化，但是普遍存在分辨率低、成本高和周期长的缺点。后者主要是针对具体的目标位点进行检测，代表性的技术有实时荧光定量PCR、多重连接探针扩增技术(MLPA) (Schouten, McElgunn et al. Nucleic Acids Res. 2002Junl5; 30 (12) : e57)和多重可扩增探针杂交(MAPH) (Armour, Sismani et al. Nucleic Acids Res. 2000Janl5; 28 (2) :605-9.) 等。实时荧光定量技术有操作简单、重复性好、实验周期短等优点，但是检测通量较小；与实时荧光定量PCR相比，MLPA和MAPH的检测通量有了很大提高，不过PCR微环境的变化会导致不同位点不能完全同步扩增，而且PCR的平台效应也会影响检测结果。以PCR为基础的检测技术存在一个共同的缺陷就是待测样本和对照样本是分开检测的，这样两者PCR效率的差异会引起检测结果的偏差。竞争性PCR克服了这个缺陷，实现CNVs的快速、准确、经济的检测。在PCR扩增过程中，PCR产物的量可以用公式Y=A (1+R) n来表示，其Y表示PCR产物的量，A表示初始模板的量，R表示PCR的扩增效率，η表示PCR的循环数，当PCR扩增效率相同时，PCR产物的量与初始模板的量成正比。竞争性PCR利用了这一原理，在同一 PCR反应体系中涉及两组模板，一组是待测样本，另一组是合成的一段核酸序列，用作内对照，两组模板仅在目标序列长度上(存在一些碱基的插入或缺失)存在一些差异，其他反应条件一致，因此两者扩增效率接近一致，两种扩增产物量的比直观的反映了初始模板(待测样本和内对照不存在拷贝数差异)量的比，可以根据内对照的初始模板的量来计算待测样本的浓度。在检测拷贝数变异时，当两模板具有相同的浓度或消除了浓度差异带来的影响时，PCR产物量的比值就反映模板拷贝数的差异。PRT 法(Paralogue Ratio Test) (Armour, Palla et al. Nucleic Acids Res. 2007; 35 (3) :el9. Epub2006Decl4)是基于竞争性PCR 的一种检测 CVNs 的一种方法，此方法的优点是待测位点和内对照共存于基因组序列中，但是缺点也是很明显的，只能针对有限的基因位点进行检测，而且针对不同检测位点都要设计一对荧光引物，加大了实验成本。对于一些基于多重竞争性PCR的定量技术，因为其PCR产物的长度必须能清晰分离，这对PCR产物的设计提出了较高的要求。对于一些PCR产物长度相近的情况则无法进行检测。本专利技术就是利用LDR技术，对PCR产物的长度不提出要求，解决了多重PCR设计的难点。
技术实现思路
所要解决的技术问题本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术一些多重竞争性PCR产物长度设计难点的问题，提供一种成本低、通量高、样本需求低、检测灵敏性高、普及度广的CNVs检测方法。技术方案在总结现有技术中各种检测方法的优缺点基础上，专利技术人经过自主创新研发，令人惊奇地发现通过如下设计，可以成功解决上述技术问题，并且成功应用于生物科学研究与临床分子诊断等领域。本专利技术的目的通过以下技术方案实现本专利技术的技术方案之一是提供一种多重竞争性PCR和LDR联合检测拷贝数变异的方法，包括以下步骤(I)提供多重竞争性PCR引物所述的多重竞争性PCR引物由分别针对待测区段和参照区段设计的至少一对待测区段引物和至少一对参照区段引物组成，TM值> 62°C，长度范围为18飞Obp，所述多重竞争性PCR引物所产生的不同扩增产物片段间的长度差异没有要求；(2)提供内对照序列通过全基因合成法合成一条与所述多重竞争性PCR的扩增产物片段之一相比仅一个替换碱基的差异的序列，且所述替换碱基的位置不在引物结合区；或者通过载体克隆法将PCR产物克隆到质粒上，并在某个碱基上导入替换突变，且所述替换突变的碱基的位置不在引物结合区；(3)多重竞争性PCR反应将含待测区段和参照区段的待测样本和对照样本分别与所述内对照的稀释液混合在一起，所述待测样本和所述对照样本的DNA分子数分别与所述内对照稀释液的DNA分子数相差10倍范围内，进行多重竞争性PCR反应；(4)多重LDR测序反应取所述多重竞争性PCR反应的产物与含所述测序探针的 LDR反应体系混合，进行LDR测序反应；(5) LDR测序产物电泳分离对所述LDR测序反应的产物进行电泳分离，利用LDR 测序反应将单碱基差异转变成序列长度差异的原理将所述待测样本或所述对照样本分别与内对照产物区分开、且利用LDR测序产物的浓度和模板浓度成线性关系的原理，通过检测LDR测序产物在电泳分离后的浓度分别获得所述待测样本、所述对照样本、和所述内对照所对应的各个模板的相对浓度，所述的相对浓度以电泳分离片段的峰高和/或峰面积表示；(6)数据分析i.将每个待测区段和参照区段的峰高和/或峰面积(S)和内对照的峰高和/或峰面积(I)作比，得到每个待测区段和参照区段的比值(S/I); 以一个参照区段的比值为标准，将其他待测区段和参照区段的比值分别同其作比，进行数据内部标化；iii.将待测样本和对照样本的内部标化值作比，获得待测样本与对照样本的比值，该比值乘以对照样本的拷贝数，得到待测样本的拷贝数。上述技术方案的优选方式之一为，所述待测区段引物和所述参照区段引物的长度范围均为38 45bp。上述技术方案的优选方式之二为，所述多重PCR引物对应的扩增产物的长度范围为 120 1000bp。上述技术方案的优选方式之三为，所述LDR测序探针对应的产物的长度范围为 70 200bp。上述技术方案的优选方式之四为，所述的多重竞争性PCR引物含一到二十五对针对不同待测基因的待测区段引物。作为另一种具体实施方式，所述的多重竞争性PCR引物本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多重竞争性PCR和LDR联合检测拷贝数变异的方法，包括以下步骤：（1）提供多重竞争性PCR引物：所述的多重竞争性PCR引物由分别针对待测区段和参照区段设计的至少一对待测区段引物和至少一对参照区段引物组成，TM值≥62℃，长度范围为18~50bp，所述多重竞争性PCR引物所产生的不同扩增产物片段间的长度差异没有要求；（2）提供内对照序列：通过全基因合成法合成一条与所述多重竞争性PCR的扩增产物片段之一相比仅一个替换碱基的差异的序列，且所述替换碱基的位置不在引物结合区；或者通过载体克隆法将PCR产物克隆到质粒上，并在某个碱基上导入替换突变，且所述替换突变的碱基的位置不在引物结合区；（3）多重竞争性PCR反应：将含待测区段和参照区段的待测样本和对照样本分别与所述内对照的稀释液混合在一起，所述待测样本和所述对照样本的DNA分子数分别与所述内对照稀释液的DNA分子数相差10倍范围内，进行多重竞争性PCR反应；（4）多重LDR测序反应：取所述多重竞争性PCR反应的产物与含所述测序探针的LDR反应体系混合，进行LDR测序反应；（5）LDR测序产物电泳分离：对所述LDR测序反应的产物进行电泳分离，利用LDR测序反应将单碱基差异转变成序列长度差异的原理将所述待测样本或所述对照样本分别与内对照产物区分开、且利用LDR测序产物的浓度和模板浓度成线性关系的原理，通过检测LDR测序产物在电泳分离后的浓度分别获得所述待测样本、所述对照样本、和所述内对照所对应的各个模板的相对浓度，所述的相对浓度以电泳分离片段的峰高和/或峰面积表示；（6）数据分析i.将每个待测区段和参照区段的峰高和/或峰面积（S）和内对照的峰高和/或峰面积（I）作比，得到每个待测区段和参照区段的比值（S/I）；ii以一个参照区段的比值为标准，将其他待测区段和参照区段的比值分别同其作比，进行数据内部标化；iii.将待测样本和对照样本的内部标化值作比，获得待测样本与对照样本的比值，该比值乘以对照样本的拷贝数，得到待测样本的拷贝数。...
【技术特征摘要】
1. 一种多重竞争性PCR和LDR联合检测拷贝数变异的方法，包括以下步骤 (1)提供多重竞争性PCR引物所述的多重竞争性PCR引物由分别针对待测区段和参照区段设计的至少一对待测区段引物和至少一对参照区段引物组成，TM值> 62°C，长度范围为18飞Obp，所述多重竞争性PCR引物所产生的不同扩增产物片段间的长度差异没有要求； (2)提供内对照序列通过全基因合成法合成一条与所述多重竞争性PCR的扩增产物片段之一相比仅一个替换碱基的差异的序列，且所述替换碱基的位置不在引物结合区；或者通过载体克隆法将PCR产物克隆到质粒上，并在某个碱基上导入替换突变，且所述替换突变的碱基的位置不在引物结合区； (3)多重竞争性PCR反应将含待测区段和参照区段的待测样本和对照样本分别与所述内对照的稀释液混合在一起，所述待测样本和所述对照样本的DNA分子数分别与所述内对照稀释液的DNA分子数相差10倍范围内，进行多重竞争性PCR反应； (4)多重LDR测序反应取所述多重竞争性PCR反应的产物与含所述测序探针的LDR反应体系混合,进行LDR测序反应； (5)LDR测序产物电泳分离对所述LDR测序反应的产物进行电泳分离，利用LDR测序反应将单碱基差异转变成序列长度差异的原理将所述待测样本或所述对照样本分别与内对照产物区分开、且利用LDR测序产物的浓度和模板浓度成线性关系的原理，通过检测LDR测序产物在电泳分离后的浓度分别获得所述待测样本、所述对照样本、和所述内对照所对应的各个模板的相对浓度，所述的相对浓度以电泳分离片段的峰高和/或峰面积表示； (6)数据分析 1.将每个待测区段和参照区段的峰高和/或峰面积(S)和内对照的峰高和/或峰面积(I)作比，...
【专利技术属性】
技术研发人员：陆炯，肖君华，陈轶群，
申请(专利权)人：上海翼和应用生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。