本发明专利技术涉及基于通用荧光引物的多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，包括下列步骤：（1）提供多重竞争性PCR引物，由至少一对通用荧光引物、至少一对位于待测区段和至少一对位于参照区段的嵌合特异引物组成；（2）构建一个全长内对照序列，通过限制性内切酶消化获得所有内对照片段；（3）多重竞争性PCR反应过程；和（4）数据分析。本发明专利技术还提供基于以上分析方法的试剂盒，适用于5~28个基因/反应的拷贝数变异的检测，是一种快速、中通量、经济的拷贝数变异检测方案。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及基于荧光通用引物的和单质粒串联多内对照的多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，应用于生物科学研究与临床分子诊断。
技术介绍
拷贝数变异(copy number variations, CNVs)是近年来发现的基因组多样性的新形式，它是指与参考序列相比，基因组中lkb 3Mb的DNA片段的结构变异现象。CNVs广泛存于基因组中，与一些遗传性疾病的发生相关，对人类抗病性和易感性表型等变异有重要影响。这就要求建立一种快速、准确和低成本的CNVs分型检测技术。随着生物技术的发展，不同的研究小组相继开发了许多的检测方法，主要包括以杂交为基础和以PCR为基础的检测技术。前者可以在全基因组水平上对CNVs进行检·测，代表技术有微阵列比较基因杂交(SolinasToldo, Lampel et al Genes ChromosomesCancer. 1997Dec; 20 (4) : 399-407)、全基因组 SNP 芯片(Irving, Bloodworth et al. CancerRes. 2005 Aprl5; 65 (8) : 3053-8)、代表性寡核昔酸微阵列技术(Lucito, Healy etal. Genome Res. 20030ct; 13 (10) : 2291-305. Epub 2003 Sep 15.)等，其优点是通量高且易于实现自动化，但是普遍存在分辨率低、成本高和周期长的缺点。后者主要是针对具体的目标位点进行检测，代表性的技术有实时荧光定量PCR、多重连接探针扩增技术(MLPA) (Schouten, McElgunn et al. NucleicAcids Res. 2002 Jun 15;30 (12):e57)和多重可扩增探针杂交(MAPH) (Armour, Sismani et al. Nucleic Acids Res. 2000 Jan15;28(2) :605-9.)等。实时荧光定量技术有操作简单、重复性好、实验周期短等优点，但是检测通量较小；与实时荧光定量PCR相比，MLPA和MAPH的检测通量有了很大提高，不过PCR微环境的变化会导致不同位点不能完全同步扩增，而且PCR的平台效应也会影响检测结果。以PCR为基础的检测技术存在一个共同的缺陷就是待测样本和对照样本是分开检测的，这样两者PCR效率的差异会引起检测结果的偏差。竞争性PCR克服了这个缺陷，实现CNVs的快速、准确、经济的检测。在PCR扩增过程中，PCR产物的量可以用公式Y=A (1+R) n来表示，其Y表示PCR产物的量，A表示初始模板的量，R表示PCR的扩增效率，η表示PCR的循环数，当PCR扩增效率相同时，PCR产物的量与初始模板的量成正比。竞争性PCR利用了这一原理，在同一 PCR反应体系中涉及两组模板，一组是待测样本，另一组是合成的一段核酸序列，用作内对照，两组模板仅在目标序列长度上(存在一些碱基的插入或缺失)存在一些差异，其他反应条件一致，因此两者扩增效率接近一致，两种扩增产物量的比直观的反映了初始模板(待测样本和内对照不存在拷贝数差异)量的比，可以根据内对照的初始模板的量来计算样本的浓度。在检测拷贝数变异时，当两模板具有相同的浓度或削除了浓度差异带来的影响时，PCR产物量的比值就反映模板拷贝数的差异。PRT 法(Paralogue Ratio Test) (Armour, Palla et al. Nucleic AcidsRes. 2007; 35 (3) :el9. Epub 2006 Decl4)是基于竞争性 PCR 的一种检测 CVNs 的一种方法，此方法的优点是待测位点和内对照共存于基因组序列中，但是缺点也是很明显的，只能针对有限的基因位点进行检测，而且针对不同检测位点都要设计一对荧光引物，加大了实验成本。内对照可以采用人工合成的方法，还有其他的一些制备方法(Zentilin and GiaccaNat Protoc. 2007; 2 (9) :2092-104.)。但如果需要同时进行十多个位点的检测时，制备多个内对照会花费很多的时间，同时后续多个内对照的定量及其相互间的混合也是非常的繁琐和复杂。所以本实验提供一个方案，可非常方便制备多个内对照且省去了后续内对照混合的过程，也大大缓解了后续实验中内对照污染的问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是填补现有技术的空白，提供一种成本低、通量较高、样本需求低、检测灵敏性高、仅制备一种质粒即能完成制备所有位点内对照操作简单的多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法。在总结现有技术中各种检测方法的优缺点基础上，专利技术人经过自主创新研发，令人惊奇地发现通过如下设计，可以成功解决上述技术问题，并且成功应用于生物科学研究与临床分子诊断等领域。本专利技术的目的通过以下技术方案实现·本专利技术的技术方案之一是提供一种多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，包括以下步骤(I)提供多重竞争性PCR引物，由至少一对通用荧光引物、至少一对位于待测区段和一对位于参照区段的上下游嵌合特异引物组成所述通用荧光引物长度范围为l(T25bp，5’端用荧光标记，TM值彡57°C值，且通用引物对待测基因组具有特异性；所述嵌合特异引物针对待测区段和参照区段设计，TM值>62°C，长度范围为28 50bp，3’端为18 25bp的特异引物序列，5’端为所述通用引物序列，所述3，端和5，端的序列之间插入两个喊基的固定组合；所述多重竞争性PCR引物所产生的不同扩增产物片段之间有可检出的长度差异；(2)提供一种全长内对照DNA，其序列特征在于所述的全长内对照含有待测区段和参照区段的引物间所有序列，每条全长内对照序列含串联的至少I个拷贝的待测区段和至少I个拷贝的参照区段，除了在每个内对照区段序列的非引物区增加或减少1-5个任意碱基使得所述的内对照序列比待测区段和参照区段长或短1-5个碱基外，每个内对照序列与待测区段和参照区段分别完全一致；相邻的内对照区段间和所述全长内对照的两侧均有限制性内切酶的酶切位点，且所述的酶切位点不存在于任何一个内对照序列中；使用时，将定量后的全长内对照DNA用限制性内切酶充分消化后，获得独立的内对照片段，定量稀释后获得内对照稀释液；(3)多重竞争性PCR反应(a)将含待测区段和参照区段的待测样本和对照样本分别与相等或整数倍摩尔数的内对照稀释液混合在一起，然后进行PCR，在前Γ16个循环中，退火温度高于所述通用荧光引物的退火温度，用于所述嵌合特异引物引导的扩增，在后17 20个循环中，退火温度低于所述通用荧光引物的退火温度，用于所述通用荧光引物引导的扩增，且两组退火温度的差距彡5°C ；(b)根据荧光标记PCR扩增产物长度不同，对扩增产物片段进行检测，获得待测样本中待测区段和参照区段以及内对照扩增产物片段的长度信息与相应的荧光强度信息；(4)数据分析i.计算每个待测区段和参照区段的样本峰高和/或峰面积(S)和内对照的峰高和/或峰面积(I)，得到每个待测区段和参照区段的比值(S/I);ii.以一个参照区段的比值为标准，将所有待测区段和参照区段的比值同其作比，进行数据内部标化；iii.按照i和ii的步骤将对照样本进行数据内部标本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，包括以下步骤：?（1）提供多重竞争性PCR引物，由至少一对通用荧光引物、至少一对位于待测区段和一对?位于参照区段的上下游嵌合特异引物组成：?所述通用荧光引物长度范围为10~25bp，5’端用荧光标记，TM值≤57℃值，且通用引物对待测基因组具有特异性；?所述嵌合特异引物针对待测区段和参照区段设计，TM值≥62℃，长度范围为28~50bp，3’端为18~25bp的特异引物序列，5’端为所述通用引物序列，所述3’端和5’端的序列之间插入两个碱基的固定组合；所有嵌合特异引物之间的TM值的差异不超过3℃；（2）所述多重竞争性PCR引物所产生的不同扩增产物片段之间有可检出的长度差异；?（3）提供一种全长内对照DNA，其序列特征在于：所述的全长内对照含有待测区段和参照区段的引物间所有序列，每条全长内对照序列含串联的至少1个拷贝的待测区段和至少1个拷贝的参照区段，除了在每个内对照区段序列的非引物区增加或减少1?5个任意碱基使得所述的内对照序列比待测区段和参照区段长或短1?5个碱基外，每个内对照序列与待测区段和参照区段分别完全一致；相邻的内对照区段间和所述全长内对照的两侧均有限制性内切酶的酶切位点，且所述的酶切位点不存在于任何一个内对照序列中；使用时，将定量后的全长内对照DNA用限制性内切酶充分消化后，获得独立的内对照片段，定量稀释后获得内对照稀释液；?（4）多重竞争性PCR反应：?(a)将含待测区段和参照区段的待测样本和对照样本分别与相等或整数倍摩尔数的内对照稀释液混合在一起，然后进行PCR，在前3~16个循环中，退火温度高于所述通用荧光引物的退火温度，用于所述嵌合特异引物引导的扩增，在后17~20个循环中，退火温度低于所述通用荧光引物的退火温度，用于所述通用荧光引物引导的扩增，且两组退火温度的差距≥5℃；?(b)根据荧光标记PCR扩增产物长度不同，对扩增产物片段进行检测，获得待测样本中待测区段和参照区段以及内对照扩增产物片段的长度信息与相应的荧光强度信息；?（5）数据分析?i.计算每个待测区段和参照区段的样本峰高和/或峰面积（S）和内对照的峰高和/或峰面积（I），得到每个待测区段和参照区段的比值（S/I）；?ii.以一个参照区段的比值为标准，将所有待测区段和参照区段的比值同其作比，进行数据内部标化；?iii.按照i和ii的步骤将对照样本进行数据内部标化；?iv.将待测样本和对照样本的内部标化值作比，获得待测样本与对照样本的比值，该比值乘以对照样本的拷贝数，得到待测样本的拷贝数。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陆炯，陈轶群，肖君华，
申请(专利权)人：上海翼和应用生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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