用于鉴定新菠萝灰粉蚧的特异性引物及PCR检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，公开了一种新菠萝灰粉蚧的特异性引物及PCR检测方法和试剂盒。本发明专利技术通过大量筛选获得特异性上游引物ITS Dn260F和下游引物ITS Dn925R。检测方法包括提取待检样品DNA、用引物进行PCR扩增、对扩增产物进行电泳分离鉴定等步骤。本发明专利技术的检测方法可以有效区分新菠萝灰粉蚧与17个近缘种类，经试验验证该检测方法特异性强、可靠性好，并具有快速、灵敏和准确等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，具体地，本专利技术涉及一种新菠萝灰粉蚧的特异性引物及PCR检测方法和试剂盒。
技术介绍
新菠萝灰粉蚧Dysmicoccusneobrevipes隶属半翅目(Hemiptera)蚧总科(Coccoidea)粉蚧科(Pseudococcidae)灰粉蚧属(Dysmicoccus)，为我国禁止进境植物检疫性有害生物，可严重危害多种水果和观赏植物，是具有重要经济意义的害虫。该虫与菠萝灰粉蚧Dysmicoccusbrevipes在形态和寄主植物及分布上极为相似。新菠萝灰粉蚧在我国广东、海南有分布，而菠萝灰粉蚧在河北、湖北、湖南、浙江、福建、江西和广东等地广泛分布。近年来，我国口岸常在泰国、菲律宾、越南等地的香蕉、龙眼、榴莲、火龙果和菠萝上截获以上两种粉蚧；其中2005～2014年间，共截获1714批次新菠萝灰粉蚧和1072批次菠萝灰粉蚧。由于粉蚧虫体小、体覆盖白色蜡粉、身体为膜状结构等特点，而虫体制作玻片步骤繁琐，成功率往往不高；另外粉蚧种间具有极其相似的外部形态，形态鉴定往往需要经验丰富的专业人员才能做到，而一线检验鉴定人员大部分不具备这样的技术要求。因此，有必要开发新的快速鉴定技术用于新菠萝灰粉蚧的分类研究。徐浪(2013)等人通过分析COI基因片段，采用DNA条形码技术鉴定了新菠萝灰粉蚧及其近缘种。编码核糖体RNA的基因(rDNA)是真核生物中最为保守的结构基因，它以衔接重复的方式排列，每一个重复包括三个编码区(分别编码18S，5.8S和28SRNA基因)，编码区之间被两个ITS(InternalTranscribedSpacers)所分隔，重复之间分别被一个ETS(ExternalTranscribedSpacer)和一个IGS(IntegenicSpacer)所分隔，由于rDNA在基因组内有数百个拷贝(增加了检测的灵敏度)和ITS及IGS区域在种内的稳定性及种间的差异，使其成为许多生物遗传变异研究的重要对象，也是近年来昆虫遗传变异、系统进化及分子鉴定研究中的一个热点。已有的研究表明：许多昆虫同一类群不同种的ITS区域在碱基序列的长度上高度保守，并无明显的差异，而核苷酸序列的却具有高度变异性，是非常理想的昆虫分子标记基因。因此ITS区序列被广泛应用于双翅目、膜翅目昆虫种下分类和近缘种鉴别(KrügerAA，2000；李正西，2001)；Doo-SangPark(2010)等人通过分析粉蚧ITS区，设计特异性引物用于区分危害韩国产雪梨上的6种粉蚧；L.L.Beuning(1999)等人基于分析ITS区差异序列，设计常规PCR引物，可特异区分新西兰常见的4种粉蚧。但是，基于ITS区用于新菠萝灰粉蚧的快速鉴定很少有相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有形态学鉴定难点，提供可快速、稳定可靠、灵敏度高地鉴定新菠萝灰粉蚧的特异性引物。本专利技术的另一目的是提供一种新菠萝灰粉蚧的特异性快速PCR检测方法。本专利技术的另一目的是提供一种新菠萝灰粉蚧的特异性快速PCR检测试剂盒。为达到上述目的之一，本专利技术采用以下技术方案：用于鉴定新菠萝灰粉蚧的特异性引物，包括：上游引物ITSDn260F：5’-CAAGTCGCCGTATCGAGTAC-3’(SEQIDNo.1)；和下游引物ITSDn925R：5’-CGGCGAGGTATCTACTGCT-3’(SEQIDNo.2)。一种新菠萝灰粉蚧的特异性PCR检测方法，所述方法包括使用以上所述引物进行PCR扩增的步骤。进一步地，该检测方法包括以下步骤：S1、提取待检样品DNA；S2、以DNA为模板，用权利要求1所述引物对ITS区域进行PCR扩增反应，获得扩增产物；S3、对扩增产物进行电泳分离，鉴定样品中是否含有新菠萝灰粉蚧。进一步地，所述步骤S2中PCR扩增反应的体系为：其中缓冲液含dNTP混合液和Mg2+。进一步地，所述上游引物ITSDn260F的浓度为10～50μmol/L，所述下游引物ITSDn925R的浓度为10～50μmol/L。进一步地，所述步骤S2中PCR扩增反应的程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min、60℃退火45s、72℃延伸45s，循环35次；72℃延伸5min。一种新菠萝灰粉蚧的特异性PCR检测试剂盒，包含以上所述的引物。本专利技术通过试验克隆鉴定了新菠萝灰粉蚧及其17个近缘种类：菠萝灰粉蚧、李比利氏灰粉蚧、杰克贝尔氏粉蚧、长尾粉蚧、暗色粉蚧、榕树粉蚧、柑栖粉蚧、柑桔棘粉蚧、康氏粉蚧、桔臀纹粉蚧、大洋臀纹粉蚧、日本臀纹粉蚧、南洋臀纹粉蚧、无花果臀纹粉蚧、双条拂粉蚧、扶桑绵粉蚧、椰子堆粉蚧的ITS序列，用于对新菠萝灰粉蚧种间遗传差异进行研究，结果显示ITS序列在新菠萝灰粉蚧种内高度保守，种间又有一定程度的变异，是比较好的研究新菠萝灰粉蚧不同种间系统发育关系的标记基因。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术根据新菠萝灰粉蚧的ITS基因序列特征，筛选、设计了特异性引物，建立了适用于新菠萝灰粉蚧不同虫态的PCR检测方法。该检测方法可以有效区分新菠萝灰粉蚧与17个近缘种类，经试验验证该检测方法特异性强、可靠性好，并具有快速、灵敏和准确等优点。灵敏性试验表明，PCR检测方法能够检测出0.1ng/μL浓度的样品。本专利技术的检测方法适用于新菠萝灰粉蚧不同虫态的检测，为我国新菠萝灰粉蚧在分子水平上的分类和近缘种的快速鉴定奠定了基础；研究结果可直接应用于进出境苗木和水果中截获的新菠萝灰粉蚧的检疫鉴定，对保护我国农林生产安全、维持生态平衡都有极为重要的意义。附图说明图1是实施例2特异性验证的电泳检测图；图2是实施例2灵敏度验证的电泳检测图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明：实施例1用于鉴定新菠萝灰粉蚧的特异性引物用新菠萝灰粉蚧及其近缘种类样品做初筛，包括引物的最适退火温度、引物特异性、引物的最适浓度等，最后从大量引物中筛选出一对最适合的特异性引物，引物的碱基序列如表1所示：表1特异性引物实施例2新菠萝灰粉蚧的特异性PCR检测方法1、试验材料试验材料为进境水果中截获的粉蚧，具体明细见下表2。表2试验用标本及编号2、试验方法(1)DNA提取：将样品置于200μL离心管中，加入60μL提取液A(含1％SDS，50mmol/LTris·Cl，25mmol/LNaCl，25mmol/LEDTA)，用研磨器研磨充分，振荡混匀后于65℃孵化45本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴定新菠萝灰粉蚧的特异性引物，其特征在于，所述引物包括：上游引物ITS Dn260F：5’‑CAAGTCGCCGTATCGAGTAC‑3’；和下游引物ITS Dn925R：5’‑CGGCGAGGTATCTACTGCT‑3’。

【技术特征摘要】
1.用于鉴定新菠萝灰粉蚧的特异性引物，其特征在于，所述引物包括：
上游引物ITSDn260F：5’-CAAGTCGCCGTATCGAGTAC-3’；和下游引物ITSDn925R：
5’-CGGCGAGGTATCTACTGCT-3’。
2.一种新菠萝灰粉蚧的特异性PCR检测方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要
求1所述引物进行PCR扩增的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取待检样品DNA；
S2、以DNA为模板，用权利要求1所述引物对ITS区域进行PCR扩增反应，获得扩增
产物；
S3、对扩增产物进行电泳分离，鉴定样品中是否含有新菠萝灰粉蚧。...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐淼锋，黄永辉，迟远丽，张卫东，权永兵，廖力，
申请(专利权)人：珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东;44