具有改进的可产生性的变体免疫球蛋白制造技术

本发明专利技术涉及免疫球蛋白分子的氨基酸序列在易于聚集的VH和VL FR和CDR3结构域和/或CH1结构域区中某些关键位置的修饰。按所述而修饰的免疫球蛋白可以表现出改进的可产生性，例如，降低的聚集倾向和/或增加的产生水平。

A variant of immunoglobulin that has improved fertility

The invention relates to a modified amino acid sequence of immunoglobulin molecules to the aggregation of VH and VL in FR and CDR3 domains and / or CH1 domains in some key positions. The modified immunoglobulin according to the said may exhibit improved availability, e.g., reduced aggregation tendency and / or increased production level.

【技术实现步骤摘要】
具有改进的可产生性的变体免疫球蛋白本申请是于2010年8月20日提交的申请号为201080040807.8，专利技术名称为“具有改进的可产生性的变体免疫球蛋白”的专利技术专利申请的分案申请。本专利技术涉及抗体分子的表达，并且具体而言，涉及具有改进的可产生性的抗体分子的制备。术语“聚集”描述了多种现象，所有现象都涉及蛋白自缔合，能在多种环境中发生，从细胞培养和发酵至分离、纯化和制备过程中都能发生。例如，描述以下情况时通常使用“聚集”：包涵体的形成；细胞分级分离后“不溶”部分中的蛋白累积；样品中出现浑浊、蛋白沉淀或形成颗粒；或者小的可溶寡聚物的形成等等。在本文中，蛋白聚集理解为多肽链的“异常自缔合”，并且可以具有多种起因和表现，这主要取决于参与的分子的性质和产生、分离、保存和给予多肽的环境。多肽的三维结构决定了其天然的生理功能。蛋白通常是在核糖体中合成后获得其天然结构。蛋白折叠的加工在根本上编码于蛋白的氨基酸序列中。然而，多种能确保多肽获得其预期的生物活性结构的分子辅助物和质量控制机制也能在体内帮助折叠，从而在加工中避免异常构象的群体。这些外部辅助物和质量控制元件包括分子伴侣、二硫键异构酶、翻译后修饰(即蛋白水解过程、酰化作用、糖基化等)以及泛素-蛋白酶体系统。此外，蛋白聚集由溶液中蛋白的内在稳定性来驱动。蛋白在溶液中仅是低度稳定的，并且这种相对低的稳定性在赋予特定生物学性质同时提供良好的调节机制来控制其作用中是很重要的。然而，例如，为了将多肽开发为药物而使其脱离于其天然环境在多肽的产生、分离和配制中造成多种严格限制，这会对多肽的稳定性和聚集行为产生巨大影响。对于指定蛋白的天然环境的改变，特别是由于特定的产生或工艺要求而导致的改变，会对蛋白的和溶液中的稳定性产生巨大影响。为了增加收率的工艺要求加重了这个问题，所述工艺要求例如：人工合成、异源表达(即哺乳动物蛋白的原核表达)、使用的是分泌途径还是非分泌途径、蛋白合成结构的饱和；或诸如多肽片段或融合体的非天然蛋白造成的其它障碍。例如，哺乳动物蛋白在异源系统中的表达会造成很多风险。这是由于该系统通常缺少合适的分子环境来保证“天然”折叠和加工这一事实造成的。本专利技术涉及以下发现：修饰免疫球蛋白分子的氨基酸序列中的某些关键位置会带来可产生性的改进，并且具体而言能使聚集倾向降低和/或增加产生水平。本专利技术的一方面提供产生变体免疫球蛋白的方法，包括：提供母体免疫球蛋白，在所述母体免疫球蛋白的VL结构域框架区和/或VLCDR3的聚集倾向区段引入取代；和/或，在VH框架区和/或VHCDR3的聚集倾向区段中引入取代；和/或在所述母体免疫球蛋白重链(CH)的CH1恒定区结构域的聚集倾向区段中引入取代，从而产生变体免疫球蛋白。所述变体免疫球蛋白相对于所述母体免疫球蛋白可以具有改进的可产生性。例如，相对于所述母体免疫球蛋白，所述变体免疫球蛋白在表达时可以表现出降低的聚集倾向和/或增加的产生能力。例如，相对于母体免疫球蛋白，变体免疫球蛋白可以表现出产生能力增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％、至少200％或至少500％，和/或相对于母体免疫球蛋白，变体免疫球蛋白可以表现出聚集降低(即，天然状态组装中发生聚集的分子的比例的降低)至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少80％、至少90％或至少99％。相对于母体免疫球蛋白，变体免疫球蛋白可以表现出聚集降低高达100％(即完全消除聚集)。可产生性的改进可以完全地或部分地来自于相对于母体免疫球蛋白的降低的聚集倾向。聚集倾向涉及免疫球蛋白在重组系统中表达后形成不溶聚集物的倾向。聚集倾向的降低能减少免疫球蛋白的天然状态系综中以聚集形式存在的分子的比例(Carpenteretal，2009JPharmSci.Apr；98(4)：1201-5)。换言之，变体免疫球蛋白的天然状态系综中以聚集或不溶形式存在的分子的比例低于母体免疫球蛋白的天然状态系综中以聚集或不溶形式存在的分子的比例。在天然条件下或在增加的温度下(例如60℃)(即免疫球蛋白的抗原结合位点不会展开的条件)，与母体免疫球蛋白相比，变体免疫球蛋白可以表现出较少的自缔合或聚集。优选地，在天然条件下(例如不会导致免疫球蛋白展开的条件)，变体免疫球蛋白表现出的自缔合或聚集少于母体免疫球蛋白。本文所述的聚集倾向不同于热学再折叠效率(TRE)，热学再折叠效率涉及蛋白在热变性后正确再折叠的能力，并且通常利用圆二色性(CD)进行测定(TanhaetalProteinEngDesSel.2006Nov；19(11):503-9)。本文所述的免疫球蛋白的聚集倾向的降低对免疫球蛋白的热学再折叠效率可以具有很小影响或没有影响。因此，热学再折叠效率与聚集倾向无关，并且对免疫球蛋白的可产生性没有显著影响。可以通过常规方法测定聚集。合适的技术包括GP-HPLC、HPLC和AUC(GabrielsonJPetalJPharmSci200796(2)：268-79)，过滤后的蛋白丢失、浊度、荧光染料结合(例如尼尔红、硫磺素T或8-苯胺基-1-萘磺酸；参见，例如Hawe,A.etalPharmaceuticalResearch200825(7)1487-99或Demeule,Betal2007IntJPharm329:37-45)、场流分离(FFF；Demeule,Betal.mAbs20091(2):142-150)和分析超离心(AU/AUC；LiuJetal.AAPSJ20068:580-9)。其它合适的方法描述于ArvinteT.In“Methodsforstructuralanalysisofproteinpharmaceuticals”AAPSPress,2005:661-6和KieseSetalJPharmSci200897(10):4347-66。可产生性的改进可以完全地或部分地来自于相对于母体免疫球蛋白的增加的产生能力。变体免疫球蛋白表现出的产生能力可以高于母体免疫球蛋白。例如，当在重组系统例如细菌或哺乳动物细胞中表达时，与母体免疫球蛋白相比，变体免疫球蛋白可以表现出增加的收率或滴度。可以利用标准技术测定产生能力，例如Bradford测定、分光光度法和ELISA。相对于母体免疫球蛋白，变体免疫球蛋白还可以表现出一种或多种下述性质：改进的纯化收率、降低的配置难度、降低的免疫原性和增加的生物利用度。在优选实施方案中，可产生性的改进可以来自于相对于母体免疫球蛋白的降低的聚集倾向和增加的产生能力两者。优选地，变体免疫球蛋白与母体免疫球蛋白表现出相同或基本上相同活性(即抗原结合活性)。免疫球蛋白是包含抗原结合位点的多肽或蛋白。抗原结合位点是免疫球蛋白中与抗原的部分或全部特异性地结合并在空间上互补的部分。当抗原较大时，免疫球蛋白可以仅结合抗原的某一部分，该部分称为表位。优选地，抗原结合结构域包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)和免疫球蛋白重链可变区(VH)，它们可以在相同或不同的多肽链上。免疫球蛋白的实例包括完整抗体，包括抗体同种型，例如IgG、IgA、IgD、IgM和IgE以及它们的同型亚类，例如IgG1和IgG4；抗体片段；以及工程化抗体衍生物，例如小免疫蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
改进免疫球蛋白的可产生性的方法，包括：鉴定具有VL结构域和VH结构域的母体免疫球蛋白，其中所述母体免疫球蛋白是完整的人或人源化抗体或者人或人源化Fab抗体片段，在所述母体免疫球蛋白的VL结构域中引入L37Q和Q45R取代、或者L46R取代；或者在所述母体免疫球蛋白的VH结构域中引入选自E1Q、Q1D、G17R、R95D、G96A、S102V、P102Y、P102V、S100dM或W103V的取代；或者在所述母体免疫球蛋白的VH结构域中引入Q1A和P102Y取代；Q1E和P102Y取代；R95D和S102V取代；H94R、R95D和S102V取代；H94R、R95D、V100F和S102V取代；S100dF和P102V取代；S100dF和P102Y取代；S100dM和P102Y取代；S100dM和P102V取代；或者在所述母体免疫球蛋白的VL结构域中引入L37Q和Q45R取代，并且在所述母体免疫球蛋白的VH结构域中引入R95D或S102V取代，或者在所述母体免疫球蛋白的VL结构域中引入L37Q和Q45R取代，并且在所述母体免疫球蛋白的VH结构域中引入R95D和S102V取代，所述母体免疫球蛋白的VH结构域和VL结构域中的所述位置根据Kabat编码方案进行编码，以及测试所述免疫球蛋白结合母体免疫球蛋白的靶抗原的能力，从而产生具有VL结构域和VH结构域的变体免疫球蛋白，所述变体免疫球蛋白由具有所引入取代的母体免疫球蛋白的VL结构域和VH结构域组成，相对于所述母体免疫球蛋白，所述变体免疫球蛋白在表达时表现出降低的聚集倾向和增加的产生能力。...

【技术特征摘要】
2009.08.21 GB 0914691.1;2009.09.11 US 61/241,7171.改进免疫球蛋白的可产生性的方法，包括：鉴定具有VL结构域和VH结构域的母体免疫球蛋白，其中所述母体免疫球蛋白是完整的人或人源化抗体或者人或人源化Fab抗体片段，在所述母体免疫球蛋白的VL结构域中引入L37Q和Q45R取代、或者L46R取代；或者在所述母体免疫球蛋白的VH结构域中引入选自E1Q、Q1D、G17R、R95D、G96A、S102V、P102Y、P102V、S100dM或W103V的取代；或者在所述母体免疫球蛋白的VH结构域中引入Q1A和P102Y取代；Q1E和P102Y取代；R95D和S102V取代；H94R、R95D和S102V取代；H94R、R95D、V100F和S102V取代；S100dF和P102V取代；S100dF和P102Y取代；S100dM和P102Y取代；S100dM和P102V取代；或者在所述母体免疫球蛋白的VL结构域中引入L37Q和Q45R取代，并且在所述母体免疫球蛋白的VH结构域中引入R95D或S102V取代，或者在所述母体免疫球蛋白的VL结构域中引入L37Q和Q45R取代，并且在所述母体免疫球蛋白的VH结构域中引入R95D和S102V取代，所述母体免疫球蛋白的VH结构域和VL结构域中的所述位置根据Kabat编码方案进行编码，以及测试所述免疫球蛋白结合母体免疫球蛋白的靶抗原的能力，从而产生具有VL结构域和VH结构域的变体免疫球蛋白，所述变体免疫球蛋白由具有所引入取代的母体免疫球蛋白的VL结构域和VH结构域组成，相对于所述母体免疫球蛋白，所述变体免疫球蛋白在表达时表现出降低的聚集倾向和增加的产生能力。2.如权利要求1所述的方法，其中相对于所述母体免疫球蛋白，所述变体免疫球蛋白表现出产生能力增加至少20％和聚集倾向降低至少30％。3.如权利要求1或2所述的方法，其中相对于所述母体免疫球蛋白序列，所述变体免疫球蛋白的序列具有如权利要求1所述的至多10处氨基酸取代。4.如权利要求1或2所述的方法，其中在所述VH结构域引入P102Y取代以及Q1A或Q1E取代。5.如权利要求1或2所述的方法，其中在所述VH结构域引入S102V取代和R95D取代。6.如权利要求5所述的方法，其中在所述VH结构域引入H94R取代和V100F取代。7.如权利要求1或2所述的方法，其中在所述VL结构域引入L37Q取代和Q45R取代。8.如权利要求1或2所述的方法，其中在所述VH结构域引入S102V取代和R95D取代，并且在所述VL结构域引入L37Q取代和Q45R取代。9.如权利要求1或2所述的方法，其中在所述VL结构域引入L37Q取代和Q45R取代，并且在所述VH结构域引入S102V取代。10.如权利要求1或2所述的方法，其中在所述VL结构域引入L37Q取代和Q45R取代，并且在所述VH结构域引入R95D取代。11.如权利要求1或2所述的方法，其中在所述VH结构域引入S100dF取代以及P102V或P102Y取代。12.如权利要求1或2所述的方法，其中在所述VH结构域引入S100dM取代以及P102V或P102Y取代。13.如权利要求1或2所述的方法，其中在所述VH结构域引入H94R和R95D取代，并且在所述VL结构域引入L46R取代。14.如权利要求1或2所述的方法，其中所述变体免疫球蛋白在重组系统中表达。15.如权利要求1或2所述的方法，其中所述变体免疫球蛋白在表达后进行分离和/或纯化。16.如权利要求1或2所述的方法，其中将所述变体免疫球蛋白与药学上可接受的赋形剂一起配制。17.评价免疫球蛋白的可产生性的方法，包括：提供免疫球蛋白；鉴定选自以下的一个或多个位置处的氨基酸残基：所述免疫球蛋白的VL结构域中的第37位、第45位和第46位，VH结构域中的第1位、第17位、第94位、第95位、第96位、第100位、第100d位和第102位，其中在所述免疫球蛋白的VL结构域中，如果第37位的残基不是Q，第45位的残基不是R，第46位的残基不是R；和/或在所述免疫球蛋白的VH结构域中...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德里亚·阿尼尔，宙斯·西门尼斯，丽贝卡·迈克尔，伊维特·斯特尔伍德，杰西·泽杜，
申请(专利权)人：英国龙沙生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB