亚铁血红素—二氧化锰复合物的制备及其用于检测人IgG的方法技术

本发明专利技术公开了亚铁血红素—二氧化锰复合物的制备及其用于检测人IgG的方法。本发明专利技术将亚铁血红素在氨水作用下溶于磷酸盐缓冲溶液，再依次加入MnAc2溶液和NaOH溶液反应，制得亚铁血红素—二氧化锰复合物(Hemin-MnO2)；Hemin-MnO2具有过氧化物酶活性，能催化双氧水氧化TMB使其由无色变为蓝色，通过传统的“三明治”夹心结构法，以Hemin-MnO2作为兔抗人IgG标记物，来进行人体免疫球蛋白IgG抗原的检测，使用Hemin-MnO2的比色免疫法检测具有稳定性好、灵敏度高、选择性好、重现性优、分析速度快等优点；该免疫传感方法简单，价格低廉，肉眼即可观察其颜色变化，具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
亚铁血红素一二氧化锰复合物的制备及其用于检测人IgG的方法
本专利技术涉及亚铁血红素一二氧化锰复合物的制备及其用于检测人IgG的方法，属于生物传感领域。
技术介绍
近年来，新型生物传感技术的构建及应用发展迅速，在临床早期诊断、环境监测、食品检测等领域得到了广泛应用。而很多传感方法及其应用受仪器及相关技术专业人员的限制而无法在许多发展中国家普及，所以构建一种简单、经济且无需借助精密仪器设备的传感方法成为科研热门研究领域。基于颜色变化来实现检测的生物免疫传感方法，因其反应迅速、方便经济、操作简单等特点而受到众多科研工作者亲睐。现有的定量检测人IgG的方法包括电化学检测法，荧光检测法、化学发光法等。但这些方法依赖于一定的仪器设备，而且不能同一时间检测多种样品，所耗时间较长。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供一种结构稳定、具有过氧化物酶活性的亚铁血红素一二氧化锰复合物的制备方法，该制备方法简单、成本低。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种基于亚铁血红素一二氧化锰复合物的检测人IgG的方法，该方法利用亚铁血红素一二氧化锰复合物催化双氧水氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)产生颜色变化，实现了人IgG检测，该方法相对传统的酶联免疫法相比，不需要使用酶作为抗体标记物，具有稳定性好、简单、灵敏度高、选择性好、价格低廉等优点，实现了人体内免疫球蛋白IgG的高通量检测。本专利技术提供了一种亚铁血红素一二氧化锰复合物的制备方法，该制备方法是将亚铁血红素与磷酸盐缓冲溶液混合后，加入氨水促使亚铁血红素溶解，再在混合溶液中依次加入过量的MnAc2溶液和过量的NaOH溶液，搅拌均匀，再离心处理后，除去未反应完的MnAc2和NaOH，即得。本专利技术的亚铁血红素一二氧化锰复合物的制备方法包括以下优选方案:所述的离心处理是在8000?IOOOOrpm的速率下离心15?25min。所述的磷酸盐缓冲溶液pH为7.4。所制得的亚铁血红素一二氧化锰复合物PBS缓冲溶液清洗2?3遍，于不大于4°C的环境下储存备用。本专利技术还提供了一种基于亚铁血红素一二氧化锰复合物的检测人IgG的方法，该方法是在聚苯乙烯96孔板的各个孔的底表面先固定羊抗人IgG，并用牛血清白蛋白将所述各个孔的底表面封闭；再在所述牛血清白蛋白封闭过的各个孔的底表面分别组装不同摩尔量的人IgG后，进一步组装亚铁血红素一二氧化锰复合物修饰兔抗人IgG ;组装完成后，在各个孔中加入等量的含H2O2和3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺的柠檬酸缓冲液进行反应，反应完成后，用酶标仪测定各个孔中3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺的氧化产物在652nm的吸光度值，进行比色分析。本专利技术的基于亚铁血红素一二氧化锰复合物的检测人IgG的方法还包括以下优选方案:优选的方法是先在聚苯乙烯96孔板的各个孔中加入羊抗人IgG静置8~12h，除去多余的羊抗人IgG，再在所述的各个孔中加入牛血清白蛋白静置2~3h，除去多余的牛血清白蛋白；再在各个孔中分别加入等体积不同浓度的人IgG溶液，在37°C下温育0.8~1.2h,除去各孔中的剩余人IgG溶液，再在各个孔中加入亚铁血红素一二氧化锰复合物修饰兔抗人IgG，在37°C下温育1.2~1.7h，除去各孔中的剩余亚铁血红素一二氧化锰复合物修饰兔抗人IgG ;最后在各个孔中加入等量的含H2O2和3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺的柠檬酸缓冲液进行反应10~20min后，用酶标仪测定各个孔中3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺的氧化产物在652nm的吸光度值，进行比色分析。所述的亚铁血红素一二氧化锰复合物修饰兔抗人IgG通过以下方法制备得到，将所述的亚铁血红素一二氧化锰复合物依次置于壳聚糖溶液、戊二醛溶液和兔抗人IgG中反应、离心处理，即得。所述的亚铁血红素一二氧化锰复合物依次置于0.3~0.8wt%的壳聚糖溶液中反应1.8~2.2h,离心3~7min,于0.2~0.3wt %的戍二醒溶液中反应0.4~0.6h,离心3~7min,于40~60 μ g ml/1的兔抗人IgG中0.8~1.2h,离心处理后，将离心物分散到磷酸盐缓冲溶液中，得到亚铁血红素一二氧化锰复合物修饰兔抗人IgG溶液。所述的磷酸盐缓冲溶液PH值优选为pH = 7.4。所述的亚铁血红素一二氧化锰复合物修饰兔抗人IgG溶液浓度为Img Inr10本专利技术的有益效果:本专利技术首次通过简单的方法合成了亚铁血红素一二氧化锰复合物(Hemin-MnO2)，发现其具有过氧化物酶活性，能催化双氧水氧化3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)使其由无色变为蓝色；本专利技术申请进一步将亚铁血红素一二氧化锰复合物作为抗体标记物应用于人IgG的检测，具有较高灵敏度，用肉眼即可辨别其颜色变化。本专利技术采用传统的“三明治”夹心结构法，在聚苯乙烯96孔微量滴定板上固定羊抗人IgG，用所合成的Hemin-MnO2复合物作为兔抗人IgG标记物，来进行人体免疫球蛋白IgG抗原的检测，发现随着抗原浓度增大，最终氧化的产物颜色也出现有规律的变化(无色一浅蓝一深蓝)，可以借助酶标仪测定的吸光度值实现人IgG的定量分析。使用Hemin-MnO2复合物的比色免疫法检测相对现有技术中传统的酶联免疫法，不需要使用酶作为抗体标记物，具有稳定性好、灵敏度高、选择性好、重现性优、分析速度快等优点。该免疫传感方法简单，价格低廉，肉眼即可观察其颜色变化，在生物技术、生物测定和生物医学方面具有潜在的应用前景。【附图说明】【图1】为本专利技术实施例1制备的Hemin-MnO2复合物的透射电子显微镜图像。【图2】为本专利技术实施例1制备的Hemin-MnO2复合物的能量色散X射线光谱图。 【图3】为本专利技术实施例1制备的Hemin-MnO2复合物以及Hemin、MnO2和TMB催化双氧水氧化TMB的显色变化图以及相应的吸光度一波长曲线图；1为TMB ;2为MnO2, 3为Hemin，4为Hemin-MnO2复合物；显色变化图从上到下依次对应曲线4、3、2和I。【图4】为不同浓度的本专利技术实施例1制备的Hemin-MnO2复合物催化氧化等量TMB的显色变化图以及相应的吸光度一波长曲线图；曲线9、8、7、6和5依次对应Hemin-MnO2复合物浓度到由高到低，显色变化图从上到下依次对应9、8、7、6和5。【图5】为是本专利技术实施例1制备的Hemin-MnO2复合物采用双抗夹心法修饰后的免疫传感器测定不同浓度人IgG抗原所得的标准曲线图。【具体实施方式】以下实施例旨在进一步说明本
技术实现思路
，而不是限制本专利技术的保护范围。实施例1新型亚铁血红素一二氧化猛复合物(Hemin-MnO2)的合成:将15mg的Hemin与IOmL pH = 7.4的PBS缓冲溶液混合后，加入50 μ L的氨水，搅拌溶解，然后边搅拌边加入1.6mL100mM的MnAc2溶液，室温下搅拌5min，然后加入100 μ LlM的NaOH溶液，继续搅拌6~8h,最终得到Hemin-M nO2复合物,然后在9000rpm下离心20min,除去多于的MnAc2和NaOH,再用PBS缓冲溶液清洗2~3遍，最后将离心得到的产物储存在4°C的冰箱中备用。本专利技术的亚铁血红素一二氧化锰复合物修饰兔抗人IgG合成方法:将合成的本文档来自技高网...

【技术保护点】
亚铁血红素—二氧化锰复合物的制备方法，其特征在于，将亚铁血红素与磷酸盐缓冲溶液混合后，加入氨水促使亚铁血红素溶解，再在混合溶液中依次加入过量的MnAc2溶液和过量的NaOH溶液，搅拌均匀，再离心处理后，除去未反应完的MnAc2和NaOH，即得。

【技术特征摘要】
1.亚铁血红素一二氧化锰复合物的制备方法，其特征在于，将亚铁血红素与磷酸盐缓冲溶液混合后，加入氨水促使亚铁血红素溶解，再在混合溶液中依次加入过量的MnAc2溶液和过量的NaOH溶液，搅拌均匀，再离心处理后，除去未反应完的MnAc2和NaOH，即得。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的离心处理是在8000?10000rpm的速率下离心15?25min。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲溶液PH为7.4。4.基于权利要求1?3任一项所述制备方法制备的亚铁血红素一二氧化锰复合物检测人IgG的方法，其特征在于，在聚苯乙烯96孔板的各个孔的底表面先固定羊抗人IgG，并用牛血清白蛋白将所述各个孔的底表面封闭；再在所述牛血清白蛋白封闭过的各个孔的底表面分别组装不同摩尔量的人IgG后，进一步组装亚铁血红素一二氧化锰复合物修饰兔抗人IgG;组装完成后，在各个孔中加入等量的含H2O2和3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺的柠檬酸缓冲液进行反应，反应完成后，用酶标仪测定各个孔中3，3’，5，5’-四甲基联苯胺的氧化产物在652nm的吸光度值,进行比色分析。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，先在聚苯乙烯96孔板的各个孔中加入羊抗人IgG静置8?12h，除去多余的羊抗人IgG，再在所述的各个孔中加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：阳明辉，郭林燕，周苗，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43