一种猪瘟重组疫苗制造技术

本发明专利技术公开了一种猪瘟重组疫苗，通过构建猪瘟病毒E2基因和Erns基因串联的真菌特异性双T-DNA安全表达载体；利用PEG法、农杆菌介导法或电击法转化食药用真菌原生质体，所述的食药用真菌为金针菇、平菇和蛹虫草、灵芝；经鉴定为阳性的菌丝体，培养获得T1代子实体，利用PCR筛选出只含目的基因而不含选择标记基因的子实体个体，培养至T2代，获得稳定表达猪瘟病毒基因的转基因食药用真菌。通过转基因真菌菌丝的发酵培养，制备猪瘟重组疫苗。利用本发明专利技术生产的猪瘟疫苗各批次间质量差异小、产量大、成本低，具有广泛的社会效益和经济效益。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程和生物医药
，具体涉及一种猪瘟重组疫苗。
技术介绍
猪痕又称“烂肠痕”，是由猪痕病毒(Classical Swine fever virus，CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，因其给人类造成巨大的经济损失和严重公共卫生问题，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病。猪瘟属于我国规定的一类烈性动物传染病，据不完全统计，猪瘟每年给我国造成的经济损失近100亿，对我国养猪业的危害极其严重。国家畜禽重大疫病攻关课题组首席科学家谢庆阁也认为，在生产实践中，有很多猪病的发生与猪痕病毒感染有关。传统疫苗的应用为我国动物疫病的防控做出了巨大贡献，目前依然是我国控制动物传染病的主要手段。传统疫苗主要包括灭活疫苗和弱毒疫苗，使用兔化弱毒疫苗株进行强制免疫控制猪瘟，仍然是我国目前最为流行和有效的防治手段。但是，常规弱毒疫苗免疫的最大缺点是难以用血清学方法与自然感染区分开，使得出口受到限制而蒙受损失。因此，开发能用血清学方法区分免疫猪与感染猪的新型疫苗(DIVA疫苗)成为当务之急。在过去的十几年中，曾经应用各种新技术针对猪瘟开发新型DIVA疫苗，但是投入了市场的只有E2亚单位疫苗。还有人尝试将E2蛋白抗原域A或者B/C缺失，制成亚单位疫苗。另外，仅含有E2部分肽段的亚单位疫苗也已有报道。目前比较成功的是杆状病毒表达的E2蛋白亚单位疫苗。因为去掉了跨膜区，表达的重组蛋白高水平地分泌到昆虫细胞培养液中。另外，有研究人员采用同样技术路线，研制出E2亚单位疫苗，这两种亚单位疫苗均已商品化。基因工程疫苗以其安全性好、质量均一、生产成本低、适合开发多价苗和联苗等诸多优点，成为新型疫苗的研究焦点和开发方向。近年来我国在兽用生物制品研发领域发展迅速，一些兽用基因工程疫苗通过注册，这为我国动物疫苗产业注入了新的生机和活力。目前已上市的兽药基因工程疫苗已经在禽流感、口蹄疫、猪伪狂犬病、猪圆环病毒病、禽法氏囊病等对畜禽养殖业危害大的疫病防控中广泛使用，并发挥了重要作用，成为传统疫苗的有效补充甚至替代品。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用食药用真菌菌丝体生物反应器生产的可饲猪瘟重组疫苗。一种融合蛋白基因E2-Erns，其碱基序列如序列表SEQ ID N0.4所示。一种融合蛋白E2_Erns，其氨基序列如序列表SEQ ID N0.5所不。一种表达载体 pCB130NG-E2-Erns，它是: I)用HindIII和EcoRI双酶切pCAMBIA1300载体，去除MCS区，经DNA聚合酶Klenow酶补平后，用T4连接酶连接形成中间载体PCB130-1 ; 2)在pCB130-l的SphI位点处引入SEQID N0.1所示的基因，包含左右边界序列和多克隆位点，构建成中间载体PCB130-2 ; 3)PCB130-2分别在PstI酶切位点处引入真菌特异性启动子GPD，在SacI与EcoRI酶切位点之间引入Nos终止子，构建成真菌特异性双T-DNA表达载体，命名为pCB130NG ; 4)经SalI和ΚρηΙ，在pCB130NG中插入SEQID N0.4所示的基因。一种食药用真菌菌丝体，它转染了所述的一种表达载体pCB130NG-E2-ErnS ; 所述的食药用真菌为蛹虫草、灵芝、金针菇或平菇。 一种食药用真菌菌丝体在制备猪瘟疫苗中的应用。本专利技术提供了一种猪瘟重组疫苗，通过构建猪瘟病毒E2基因和Erns基因串联的真菌特异性双T-DNA安全表达载体；利用PEG法、农杆菌介导法或电击法转化食药用真菌原生质体，主要涉及的食药用真菌为金针菇、平菇和蛹虫草、灵芝；经鉴定为阳性的菌丝体，培养获得Tl代子实体，利用PCR筛选出只含目的基因而不含选择标记基因的子实体个体，培养至T2代，获得稳定表达猪瘟病毒基因的转基因食药用真菌。通过转基因真菌菌丝的发酵培养，制备猪瘟重组疫苗。利用本专利技术生产的猪瘟疫苗各批次间质量差异小、产量大、成本低，具有广泛的社会效益和经济效益。利用本专利技术制备的猪瘟可饲基因工程疫苗，具有以下优点: 1.生产成本低，且易形成规模化产业，生产转基因口服疫苗工艺简单，不需要昂贵的培养基和复杂的纯化过程，也不需要严格的无菌生产和冷藏保存。2.转基因可饲疫苗生产成品储存简单。不需要冷冻、冷藏，还有利于运输，这不仅降低了成本，还可以随时预防接种。3.预防接种简单易行，转基因植物疫苗可通过饲喂而进行免疫，在进行大范围预防接种时，大大节省了人力和时间。4.使用安全。对免疫接种动物来说，表达系统中的非目的成分对动物无害，不存在其他潜在动物病原体污染的可能；免疫接种时，不需要注射器和针头之类的设备，不存在通过注射接种动物感染病原微生物的可能。5.在E2蛋白基础上开发的亚单位疫苗不仅会赋予猪对抗CSFV野毒株的广泛保护，而且很容易通过检测抗Erns的抗体将免疫猪和感染猪区分开。【附图说明】图1真菌特异性双T-DNA安全表达载体pCB130NG示意图； 图 2 pCB130NG-E2-Erns 质粒酶切； 图3转基因蛹虫草菌丝的PCR检测； 图4转基因蛹虫草子实体的PCR检测。【具体实施方式】实施例1.真菌特异性双T-DNA安全表达载体的构建 利用PCAMBIA1300载体作为基础载体，首先通过历λΛΙΙ和EcoRi双酶切，去除MCS区，经DNA聚合酶Klenow酶补平后，用Τ4连接酶连接形成中间载体pCB130_l。接下来，通过基因合成技术在中间载体的办Al位点处引入一段序列(SEQ ID N0.1)，包含左右边界序列和多克隆位点，构建成中间载体PCB130-2。在此载体基础上，通过PCR技术及酶切与连接方法，分别在Pstl酶切位点处引入真菌特异性启动子fi^KSEQ ID N0..2)，在Sad与EcoRV酶切位点之间引入愈?终止子(SEQ ID N0..3)，构建成真菌特异性双T-DNA表达载体，命名为PCB130NG，该载体示意图见图1。实施例2.猪瘟重组疫苗E2_Erns的设计 为了提高猪瘟疫苗的免疫效果和将免疫猪和感染猪区分开，将猪瘟病毒E2基因和Erns基因串联一起进行构建；同时，为使两个病毒蛋白表达后在空间上隔开，在两基因之间添加一个短的核苷酸 Linker:CGGTGGATCCGGCGGTGGTGGATCTGGTGGCGGCGGATCT ;为便于表达后的检测，在E2基因的5’末端和Erns基因的3’末端均加上6个His标签。得到的猪瘟重组疫苗E2-Erns氨基酸序列为SEQ ID N0.4，委托生物公司合成。实施例3.猪瘟病毒基因E2_Erns表达载体的构建 通过Genebank查找猪瘟病毒E2基因(FJ598612.1)和Erns基因(JQ178244.1)序列，根据真菌对密码子的偏爱性，对目的基因进行密码子优化后，利用人工合成方法将两基因串联，引入到改造后的双T-DNA安全表达载体pCB130NG (图1)中，两侧酶切位点分别为:上游加(GTCGAC)，下游加Kpnl (GGTACC)。经过酶切鉴定(当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合蛋白基因E2‑Erns，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李海燕，李晓薇，李玉，王法微，杨贺，李校堃，王琦，刘秀明，姚娜，孙天旭，董园园，王南，王秀然，卢天成，王岩，孙喆，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22