本发明专利技术提供一种对大肠杆菌Ｏ９５型（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ９５）的Ｏ－抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌型中控制Ｏ－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的分离的核苷酸，全长１３９３２个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的核苷酸；还包括源于大肠杆菌Ｏ９５型的Ｏ－抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因的寡核苷酸；本发明专利技术通过ＰＣＲ证实寡核苷酸对大肠杆菌Ｏ９５型的Ｏ－抗原都有高度的特异性；本发明专利技术还公开了用本发明专利技术的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌Ｏ９５型的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及大肠杆菌O95型(Escherichia coli O95)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O95型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O95型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。
技术介绍
O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间。O-抗原基因簇含有三类基因糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的志贺氏菌有46种血清型，但只有33种不同的O-抗原，大肠杆菌有166种不同的O-抗原，二者亲缘关系非常近，并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种对大肠杆菌O95型的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O95型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基转移酶基因和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。本专利技术的次一目的是提供了大肠杆菌O95型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。本专利技术的另一目的是提供了构成大肠杆菌O95型的O-抗原基因簇的基因即ABC转运系统的基因，包括wzm、wzt基因；糖基转移酶基因，包括orf5基因。本专利技术的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O95型的O-抗原基因簇中编码ABC转运系统的基因，包括wzm、wzt基因；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O95型的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O95型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O95型的O-抗原也是高度特异的。本专利技术的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法检测和鉴定大肠杆菌O95型的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O95型。本专利技术的还一目的是提供了分离大肠杆菌O95型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。本专利技术的目的是由以下技术方案实现的。本专利技术对大肠杆菌O95型的O-抗原特异的核苷酸，其是如SEQ ID NO1所示的分离的核苷酸，全长13932个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。前述的对大肠杆菌O95型的O-抗原特异的核苷酸，其中包括命名为rmlB，rmlA，orf3，orf4，orf5，orf6，orf7，wzm，wzt，orf11，orf12，orf13的13个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。前述的对大肠杆菌O95型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述基因中具有高度特异性的基因是ABC转运系统的wzm基因；糖基转移酶基因，包括orf5基因；其中所述的基因wzm是SEQ ID NO1中的8944至9762碱基的核苷酸；orf5是SEQ ID NO1中的4268至5914碱基的核苷酸。前述的对大肠杆菌O95型的O-抗原特异的核苷酸，其中它是源于所述的wzm基因、糖基转移酶基因orf5基因；以及它们的混合或它们的重组。前述的对大肠杆菌O95型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其中源于orf5基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的4350至4365碱基的核苷酸和4888至4903碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5246至5263碱基的核苷酸和5690至5707碱基的核苷酸。源于wzm基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的9347至9364碱基的核苷酸和9743至9758碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的9160至9175碱基的核苷酸和9650至9665碱基的核苷酸。前述的对大肠杆菌O95型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原中的应用。前述的对大肠杆菌O95型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，在通过插入表达而提供表达大肠杆菌O95型的O-抗原，以及制备细菌疫苗中的应用。前述的对大肠杆菌O95型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测细菌的应用。前述的对大肠杆菌O95型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤(1)基因组的提取在培养基中培养大肠杆菌O95型，离心收集细本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种对大肠杆菌Ｏ９５型的Ｏ－抗原特异的核苷酸，其特征在于：其是如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的分离的核苷酸，全长１３９３２个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的核苷酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王磊，王威，冯露，
申请(专利权)人：天津生物芯片技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]
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