一种水中噬菌体分离方法技术

本发明专利技术公开了一种水中噬菌体分离方法，包括如下步骤：(1)正电荷硅胶颗粒的制备；(2)洗脱液的配制；(3)噬菌体的分离，本发明专利技术的方法能够高效的分离各种水环境如自来水、地表水和污水中的噬菌体，分离效率高，对水中极低浓度的噬菌体(100PFU/100L)的分离效率达到了70％。本方法具有操作简便、快速及价格低廉等优点，因此该方法将加速从水环境中分离新的噬菌体的速度，为噬菌体的应用提供帮助。

【技术实现步骤摘要】
一种水中噬菌体分离方法
本专利技术属于微生物分离技术，特别是涉及一种水中噬菌体分离方法。
技术介绍
噬菌体是感染细菌、放线菌或支原体等原核微生物的细菌病毒的总称，它是病毒的一种。噬菌体的发现可追溯至100多年以前，1896年英国细菌学家ErnesHankin首次报道了印度河水存在一种能通过瓷性滤器，热不稳定性的并具有强抗菌活性的物质，遗憾的是Hankin没能继续该方面的研究。直到1915年，英国微生物学家FrederickTwort首次在涂有金黄色葡萄球的培养基上发现了透明斑，并将该现象进一步阐述为病毒感染的假说。加拿大微生物学家Félixd’Herelle在1917年正式将该病毒命名为噬菌体。噬菌体结构简单，仅由外面的衣壳蛋白和内部的核酸组成，其核酸物质可分为dsDNA、ssDNA、dsRNA和ssRNA。噬菌体的一个主要性能就是能够专一的裂解其宿主菌，人们以此发现了噬菌体的广泛用途，主要包括用于治疗多重耐药菌感染的噬菌体治疗、灭活食品、水和植物中的致病菌的生物控制与噬菌体检测等。噬菌体在自然界中分布广泛，几乎有细菌生存的地方就存在相应的噬菌体，其数量达到1032，是细菌的10倍左右。由于噬菌体对宿主菌的专一裂解的特点，使得噬菌体的应用受到了限制，人们为此而专利技术了鸡尾酒疗法，这也就需要更多不同的噬菌体。但是，到目前为止，只有6000多株噬菌体被发现且进行了形态学的描述，这与自然界中存在的噬菌体实际数量存在着巨大差距。随着噬菌体的广泛应用，人们需要获得更多的噬菌体，但是，新的噬菌体发现速度却远远不能满足这种迫切需求。传统的水中噬菌体分离方法所针对的水样体积一般只有1-1000mL，因此很难分离到水中浓度较低的噬菌体。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种使用方便的，能处理大水样的水中噬菌体分离方法。本专利技术的技术方案概述如下：一种水中噬菌体分离方法，包括如下步骤：(1)正电荷硅胶颗粒的制备①按比例，室温下称取6-7g氯化铝缓慢加入到950mL蒸馏水中使溶解；加入45mL、2M碳酸钠水溶液，出现乳白色的Al(OH)3凝胶，调节pH值至7.0-7.5，加水定容至1000mL；在室温下静置18-24h；②将步骤①获得的液体以1100g离心10-30min后弃上清；向沉淀中加入0.14M氯化钠水溶液至1000mL重悬沉淀，静置18-24h；③重复步骤②2-4次，于121℃高压灭菌20min，冷却至常温；④取1200-1400g粒径为150-300μm硅胶加入到步骤③获得的液体中，边加边搅拌，使之充分混匀，置于50-100℃烤箱中烤干，得到正电荷硅胶颗粒；(2)洗脱液的配制称取30g胰蛋白胨、15g牛肉粉、15g氯化钠、30-40g甘氨酸和20-30g氢氧化钠加蒸馏水至1L，加热溶解，调节pH为10.2-10.5，在121℃下高压灭菌20min；(3)噬菌体的分离：①在层析柱中加入适量灭菌蒸馏水，再加入正电荷硅胶颗粒不断搅拌去除气泡，通过蠕动泵以300-700mL/min速度将待测水样从层析柱的顶部流过层析柱；②当待测水样全部流过层析柱后，用相当于正电荷硅胶颗粒质量3-4倍的洗脱液洗脱，收集洗脱流出液，调节pH为7.0-7.5；加入PEG6000使质量浓度为10％-15％并在搅拌下使PEG6000溶解，在常温下静置20-40min，12000-16000g离心20-40min，弃上清液，用0.1MpH＝7.0-7.5的PBS重悬沉淀并定容至10-100mL得液体1，向液体1中加入10×液体培养基，所述10×液体培养基的加入体积为液体1体积的1/10，得液体2；③另取1mL10×液体培养基加灭菌生理盐水至10mL得1×液体培养基，将噬菌体的宿主菌接种至1×液体培养基中，30-37℃下培养18-24h；④取1mL步骤(3)③获得的菌液接种至液体2中，30-37℃下培养18-24h，然后3000-4000g离心10-20min，收集上清液，取1mL上清液与100μL步骤(3)③获得的菌液混匀后静置5min，采用双层平板法检测上清液中是否有噬菌斑出现。噬菌体的宿主菌为大肠埃希氏菌、沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157︰H7、金黄色葡萄球菌、粪链球菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌或小肠结肠炎耶尔森菌。本专利技术的优点：本专利技术的方法能够高效的分离各种水环境如自来水、地表水和污水中的噬菌体，分离效率高，对水中极低浓度的噬菌体(100PFU/100L)的分离效率达到了70％。本方法具有操作简便、快速及价格低廉等优点，因此该方法将加速从水环境中分离新的噬菌体的速度，为噬菌体的应用提供帮助。附图说明图1为颗粒扫描电镜图：a为硅胶颗粒，b正电荷硅胶颗粒。图2为硅胶颗粒和正电荷硅胶颗粒粒径分布图。具体实施方式为了使本领域的技术人员更好的理解本专利技术的技术方案，下面结合具体实施方式对本专利技术所述技术方案作进一步的详细说明。实施例1经检测无大肠埃希氏菌噬菌体MS2的自来水(在本实施例简称为自来水)中加入大肠埃希氏菌噬菌体MS2的分离，包括如下步骤：(1)正电荷硅胶颗粒的制备①室温下称取6.675g氯化铝缓慢加入到950mL蒸馏水中使溶解；加入45mL、2M碳酸钠水溶液，出现乳白色的Al(OH)3凝胶，调节pH值至7.2，加水定容至1000mL；在室温下静置24h；②将步骤①获得的液体以1100g离心15min后弃上清；向沉淀中加入0.14M氯化钠水溶液至1000mL重悬沉淀，静置24h；③重复步骤②3次，于121℃高压灭菌20min，冷却至常温；④取1375g粒径为270μm硅胶加入到步骤③获得的液体中，边加边搅拌，使之充分混匀，置于60℃烤箱中烤干，得到正电荷硅胶颗粒；(2)洗脱液的配制称取30g胰蛋白胨、15g牛肉粉、15g氯化钠、37.5g甘氨酸和20g氢氧化钠加蒸馏水至1L，加热溶解，用0.1mol/L盐酸溶液或0.1mol/L氢氧化钠水溶液调节pH为10.2，在121℃下高压灭菌20min；(3)噬菌体的分离：①在100L自来水中加入硫代硫酸钠(每升水中加入0.5mL质量浓度为10％硫代硫酸钠水溶液)以中和水中的余氯，然后在水样接种1ml噬菌体MS2(100PFU/100L)，并充分混匀得待测水样；在内径为83.5mm、高为400mm的层析柱中加入1.5L灭菌蒸馏水，再加入800g正电荷硅胶颗粒不断搅拌去除气泡，通过蠕动泵以500mL/min速度将待测水样从层析柱的顶部流过层析柱；②当待测水样全部流过层析柱后，用2800g的洗脱液洗脱，收集洗脱流出液，调节pH为7.2；加入PEG6000使质量浓度为13％并在搅拌下使PEG6000溶解，在常温下静置30min，15000g离心30min，弃上清液，用0.1MpH＝7.2的PBS重悬沉淀并定容至50mL得液体1，向液体1中加入5mL10×的LB液体培养基，得液体2③另取1mL10×LB液体培养基加灭菌生理盐水至10mL得1×LB液体培养基，将噬菌体的宿主菌大肠埃希氏菌15597接种至1×LB液体培养基中，35℃下培养24h；④取1mL步骤(3)③获得的菌液接种至液体2中，37℃下培养24h，然后4000g离心10min，收集上清液，取1mL上清液与100μL步骤(3)③获得的菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水中噬菌体分离方法，其特征包括如下步骤：(1)正电荷硅胶颗粒的制备①按比例，室温下称取6‑7g氯化铝缓慢加入到950mL蒸馏水中使溶解；加入45mL、2M碳酸钠水溶液，出现乳白色的Al(OH)3凝胶，调节pH值至7.0‑7.5，加水定容至1000mL；在室温下静置18‑24h；②将步骤①获得的液体以1100g离心10‑30min后弃上清；向沉淀中加入0.14M氯化钠水溶液至1000mL重悬沉淀，静置18‑24h；③重复步骤②2‑4次，于121℃高压灭菌20min，冷却至常温；④取1200‑1400g粒径为150‑300μm硅胶加入到步骤③获得的液体中，边加边搅拌，使之充分混匀，置于50‑100℃烤箱中烤干，得到正电荷硅胶颗粒；(2)洗脱液的配制称取30g胰蛋白胨、15g牛肉粉、15g氯化钠、30‑40g甘氨酸和20‑30g氢氧化钠加蒸馏水至1L，加热溶解，调节pH为10.2‑10.5，在121℃下高压灭菌20min；(3)噬菌体的分离：①在层析柱中加入适量灭菌蒸馏水，再加入正电荷硅胶颗粒不断搅拌去除气泡，通过蠕动泵以300‑700mL/min速度将待测水样从层析柱的顶部流过层析柱；②当待测水样全部流过层析柱后，用相当于正电荷硅胶颗粒质量3‑4倍的洗脱液洗脱，收集洗脱流出液，调节pH为7.0‑7.5；加入PEG6000使质量浓度为10％‑15％并在搅拌下使PEG6000溶解，在常温下静置20‑40min，12000‑16000g离心20‑40min，弃上清液，用0.1MpH＝7.0‑7.5的PBS重悬沉淀并定容至10‑100mL得液体1，向液体1中加入10×液体培养基，所述10×液体培养基的加入体积为液体1体积的1/10，得液体2；③另取1mL10×液体培养基加灭菌生理盐水至10mL得1×液体培养基，将噬菌体的宿主菌接种至1×液体培养基中，30‑37℃下培养18‑24h；④取1mL步骤(3)③获得的菌液接种至液体2中，30‑37℃下培养18‑24h，然后3000‑4000g离心10‑20min，收集上清液，取1mL上清液与100μL步骤(3)③获得的菌液混匀后静置5min，采用双层平板法检测上清液中是否有噬菌斑出现。...

【技术特征摘要】
1.一种水中噬菌体分离方法，其特征由如下步骤组成：(1)正电荷硅胶颗粒的制备①按比例，室温下称取6-7g氯化铝缓慢加入到950mL蒸馏水中使溶解；加入45mL、2M碳酸钠水溶液，出现乳白色的Al(OH)3凝胶，调节pH值至7.0-7.5，加水定容至1000mL；在室温下静置18-24h；②将步骤①获得的液体以1100g离心10-30min后弃上清；向沉淀中加入0.14M氯化钠水溶液至1000mL重悬沉淀，静置18-24h；③重复步骤②2-4次，于121℃高压灭菌20min，冷却至常温；④取1200-1400g粒径为150-300μm硅胶加入到步骤③获得的液体中，边加边搅拌，使之充分混匀，置于50-100℃烤箱中烤干，得到正电荷硅胶颗粒；(2)洗脱液的配制称取30g胰蛋白胨、15g牛肉粉、15g氯化钠、30-40g甘氨酸和20-30g氢氧化钠加蒸馏水至1L，加热溶解，调节pH为10.2-10.5，在121℃下高压灭菌20min；(3)噬菌体的分离：①在层析柱中加入适量灭菌蒸馏水，再加入正电荷硅胶颗粒不断搅拌去除气泡，通过蠕动泵以300-700mL/min速度将待测水样从层析柱的顶部流过层析柱；②当待测水样全部流过层析柱后，...

【专利技术属性】
技术研发人员：谌志强，李君文，王新为，金敏，邱志刚，杨栋，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12