猪链球菌噬菌体穿孔素的制备方法技术

一种生物材料技术领域的猪链球菌噬菌体穿孔素的制备方法，通过纯化得到猪链球菌２型烈性噬菌体，提取噬菌体的ＤＮＡ；以步骤一所得ＤＮＡ为模板，应用ＰＣＲ扩增穿孔素基因；原核表达步骤二扩增所得ＤＮＡ，得到融合蛋白；纯化融合蛋白，复性，得到穿孔素。本发明专利技术获得的纯化的有活性的穿孔素，它可在体外裂解多株猪链球菌或增强裂解酶的裂解效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物材料
的制备方法，具体是一种能够裂解或增强裂解 酶裂解猪链球菌的穿孔素(Holin)的制备方法。
技术介绍
猪链球菌病是一种人兽共患传染病，能导致仔猪患脑膜炎、败血症、关节炎、心内 膜炎、肺炎和人的脑膜炎。猪链球菌2型流行最广，对猪的致病力也最强，给养猪业造成巨 大的经济损失，在公共卫生方面，对相关从业人员的生命安全构成严重威胁。对于猪链球 菌病的治疗主要是抗生素治疗，然而，随着抗菌药物的广泛应用，耐药菌株的产生进一步加 剧。穿孔素是由噬菌体基因组编码的一种疏水性的跨膜蛋白，在特定阶段插入胞质膜形成 非特异性的孔洞或损伤，促使裂解酶能接近其作用靶位，有效调节裂解酶裂解细菌。噬菌体 穿孔素与裂解酶配合使用，能大大提高裂解酶特异性攻击细菌的效率。所以，穿孔素作为新 型抗菌药物具有一定的优势。本专利技术通过原核表达猪链球菌烈性噬菌体SMP的holin基因， 获得了纯化的有活性的穿孔素，在体外可对多株临床分离的猪链球菌有裂解作用。经文献检索发现，王丽平、陆承平、唐家琪在《微生物学报》2004年第44卷第6期 第794 799页发表了 “32种抗菌药物对临床分离猪源链球菌的体外抗菌活性”，文中提 及，一些猪场分离的猪链球菌对32种抗菌药物的耐药性的研究结果显示，临床分离菌株以 耐药菌为主，且大都呈多重耐药，尤其对磺胺类药物、林可胺类、四环素类、大环内酯类、氨 基甙类药物的耐药性最为严重，耐药不仅普遍，且多为高度耐药，寻找另一种抗菌机制或抗 菌药物显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种裂解猪链球菌的穿孔素的制备 方法。本专利技术获得的纯化的有活性的穿孔素，它可在体外裂解多株猪链球菌或增强裂解酶 的裂解效率。本专利技术是通过以下的技术方案实现的，本专利技术包括如下步骤步骤一，纯化得到猪链球菌2型烈性噬菌体，提取噬菌体的DNA ；步骤二，以步骤一所得DNA为模板，应用PCR扩增穿孔素基因；步骤三，原核表达步骤二扩增所得DNA，得到融合蛋白；步骤四，纯化融合蛋白，复性，得到穿孔素。步骤三中，所述的原核表达采用的质粒是pET_28a(+)，表达的穿孔素分子约 16kDa。步骤三中，所述的融合蛋白是指一个分子量为16kDa的融合蛋白。步骤四中，所述的纯化融合蛋白是指经过M柱纯化，得到有活性的穿孔素。所述的步骤四中的穿孔素发挥最佳裂解作用的条件是采用pH5. 2醋酸钠缓冲 液、最佳反应温度是37°C。本专利技术利用PCR扩增猪链球菌烈性噬菌体SMP的holin基因，获得目的片断，再将 目的片断与pET-28a (+)载体连接，得到重组表达质粒，导入大肠杆菌BL21表达，经纯化得 到有活性的穿孔素，获得的穿孔素在体外可裂解或增强裂解酶对多株临床分离的猪链球菌 的裂解作用，并且对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌具有独立裂解作用。与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果本专利技术通过原核表达猪链球菌烈 性噬菌体SMP的holin基因，获得纯化的有活性的穿孔素，它可在体外裂解多株猪链球菌或 增强裂解酶的裂解效率。比较噬菌体穿孔素与裂解酶对细菌的裂解效率发现，裂解酶对高 压处理过的猪链球菌具有裂解作用，当加入穿孔素后，其与裂解酶可协同、高效裂解未经处 理的猪链球菌，裂解效率显著提高。 具体实施例方式以下实例对本专利技术作进一步说明。本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实 施，给出了详细的实施方式和过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。下列实施 例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如实验室手册(New York =Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例一、噬菌体的提纯、DNA的制备和穿孔素的表达步骤一，取平板上长成密集相连噬斑的噬菌体SMP (Ma，Y. L.，Lu，C. P.，Isolation andidentification of a bacteriophage capable of infecting Streptococcus suis type 2strains. Veterinary Microbiology, 2008，132 :340_347，全基因组序列已提交 GenBank，登录号EF116926.)，每板加入5mL SM(噬菌体稀释液，每升含5. 8g NaCl，2g MgS04 · 7H20，50mL IM Tris_Cl，pH 7.5，5mL 2% 明胶)，4°C摇床晃动 3 小时，收集 SM 液放 无菌离心管4000g离心10分钟去除细胞碎片。上清液加入胰DNaseI和RNaseI至终浓度 为1 μ g/mL，37°C温育30分钟。加入NaCl至终浓度lmol/L，冰浴1小时后，4°C IlOOOg离 心10分钟，收集上清。上清液加入PEG 8000至终浓度10%室温搅拌溶解后冰浴1小时，使 噬菌体颗粒发生沉淀。40C 12000g离心10分钟，弃上清，沉淀的噬菌体颗粒用SM液过夜重 ；塁、ο步骤二，在重悬液中加入20mg/mL蛋白酶K至终浓度50μ g/mL，37°C温育30分钟， 再加10% SDS至终浓度为0. 5%，混勻后将消化混合物于56°C温育1小时，冷却至室温。用 等体积酚/氯仿抽提，3000g离心5分钟将两相分开，将亲水相收集至另一个离心管中。在 回收的亲水相中加入3mol/L乙酸钠至终浓度0. 3mol/L，混勻后加两倍体积的无水乙醇轻 轻洗涤，13000g离心2分钟，弃上清，回收DNA沉淀。用适当体积的TE (核酸溶解缓冲液) 溶解噬菌体DNA。步骤三，holin基因的原核表达(1)猪链球菌烈性噬菌体SMP holin基因的克隆根据猪链球菌烈性噬菌体SMP的基因序列设计引物进行PCR扩增。连接到pMD_18T 载体(Takara公司)上测序。所设计的引物上游包含EcoR I限制性酶切位点，下游包含 XhoI限制性酶切位点。(2)表达载体的构建EcoR I 和 Xho I 分别酶切 PCR 产物和 pET_28a (+)，T4DNA 连接酶(Takara 公 司)10 16°C过夜连接。连接产物转入大肠杆菌DH5 α中，37°C过夜培养，提取质粒。用 EcoR I和XhoI酶切鉴定。鉴定的阳性重组质粒测序。(3)融合蛋白的表达筛选阳性克隆提取质粒，转入大肠杆菌BL21(祝昊丹，顾宏伟，陆承平.体内 表达新基因trag在猪链球菌的分布及其免疫反应性分析，微生物学报，2008,48(12) 1642-1648)中。挑取1个菌落接种5ml卡那霉素LB培养基过夜培养。取5mL过夜培养 菌液接种IL卡那霉素LB培养基，37 °C 200转/分摇菌培养5h，至0D600为0. 4 1。加 IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)至终浓度为lmM，27°C摇菌培养4h后，收取菌液。(4) SDS-PAGE 电泳配制12%的分离胶和5%的浓缩胶，样品用上样缓冲液沸水煮4min，浓缩胶电压 80V，分离胶电压136V，电泳4 5h，考马斯亮兰染色2h。脱色观察，在16kDa处有明显的条 带出现。二、融合蛋白的纯化IPTG诱导的细菌IL溶于25mL预冷的裂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪链球菌噬菌体穿孔素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：　　步骤一，纯化得到猪链球菌２型烈性噬菌体，提取噬菌体的ＤＮＡ；　　步骤二，以步骤一所得ＤＮＡ为模板，应用ＰＣＲ扩增穿孔素基因；　　步骤三，原核表达步骤二扩增所得ＤＮＡ，得到融合蛋白；　　步骤四，纯化融合蛋白，复性，得到穿孔素。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙建和，李宁，严亚贤，史一博，陆承平，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]