修饰的脑膜炎球菌fHbp多肽制造技术

本发明专利技术人已经鉴定了脑膜炎球菌fHbp的可以被修饰以增加其稳定性的变体2和变体3中的残基。

Modified meningococcal fHbp polypeptide

The inventor has identified variants of meningococcal fHbp that can be modified to increase their stability in variants 2 and 3.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请要求欧洲专利申请14157399.8(2014年2月28日提交)和14177566.8(2014年7月17日提交)的权益，其二者的完整内容为了所有目的通过引用并入本文。
本专利技术在蛋白工程改造的领域中，具体涉及脑膜炎球菌因子H结合蛋白(fHbp)，其已知是有用的疫苗免疫原。
技术介绍
脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)是一种革兰阴性荚膜细菌，其寄居在大约10％人群的上呼吸道。可获得针对血清群A、C、W135和Y的缀合物疫苗可用，但可用于在两个剂量方案中预防血清群B的唯一疫苗是在2013年批准的BEXSERO™产品。BEXSERO™中的保护性免疫原之一是fHbp，其也被称为蛋白‘741’(参考文献中的SEQIDNO:2536；本文中的SEQID1)，‘NMB1870’，‘GNA1870’[2-4]，‘P2086’，‘LP2086’或‘ORF2086’[5-7]。该蛋白的3D结构是已知的[8，9]，且该蛋白具有通过短接头连接的两个β-桶。许多出版物都报道了该蛋白在脑膜炎球菌疫苗中的保护效力，例如参见参考文献10-14。fHbp脂蛋白在所有血清群的各种菌株中都表达。已将fHbp序列分为三种变体[2](在本文中称为v1、v2和v3)，并且已通常发现针对给定变体产生的血清针对表达该变体的菌株是杀细菌的，但其对表达其它两种变体之一的菌株无活性，即存在变体内交叉保护、但不存在变体间交叉保护(除了一些v2和v3交叉反应性)。为了增加家族内交叉反应性，fHbp序列已被工程改造以含有针对所有三种变体的特异性[15]。蛋白工程改造也已经被用于去除fHbp与铁载体[16]和与因子H[17-25]的相互作用。对于所有三种变体已经报道了与fH的相互作用的破坏，并且据推测提供了优异的疫苗免疫原[22，26]。然而，对于v2多肽，参考文献23和24报道了固有不稳定性，这也见于fH结合被破坏的突变体。该不稳定性似乎由N-末端β-桶结构域导致，并且参考文献23警告，该桶中的任何取代可能促进不稳定。本专利技术的一个目标是提供进一步的fHbpv2和v3突变体，但具有增强的稳定性。专利技术公开内容v2中来自菌株2996的全长fHbp具有以下氨基酸序列(SEQIDNO:2)：MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ成熟脂蛋白缺乏SEQIDNO:2的前19个氨基酸(加下划线；提供了SEQIDNO:4)，且SEQIDNO:2的ΔG形式缺乏前26个氨基酸(SEQIDNO:5)。v3中来自菌株M1239的全长fHbp具有以下氨基酸序列(SEQIDNO:3)：MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ成熟脂蛋白缺乏SEQIDNO:3的前19个氨基酸(加下划线；提供了SEQIDNO:40)，且SEQIDNO:3的ΔG形式缺乏前31个氨基酸(SEQIDNO:17)。本专利技术人已经鉴定了SEQIDNO:2和SEQIDNO:3内可以被修饰以增加多肽的稳定性的残基。这些残基通常跨越v2和v3序列存在，所以其修饰可以提供具有增强稳定性的v2和v3fHbp序列。而且，本专利技术人已经显示，除了增加稳定性以外，这些残基的突变可以有利地减少与人因子H(fH)的结合。然而，此外，本文公开的突变可以与其它突变组合，例如以减少与人因子H(fH)的结合，其中几个突变是本领域中已知的。因此，通常本专利技术提供了突变体v2或v3fHbp，其相对于野生型fHbp(例如，相对于SEQIDNO:2或3)具有增加的稳定性，并且，任选地，其对于人因子H比对于野生型fHbp(例如，相对于SEQIDNO:2或3)具有更低的亲和力。稳定性的增加和fH亲和力的任选降低优选由一种或多种相同突变导致，但是在一些实施方案中，它们可能是由于组合突变的分开作用。具有增加的稳定性和降低的fH亲和力两者的突变体fHbp蛋白是优选的。在第一个实施方案中，本专利技术提供了包含突变体fHbpv2氨基酸序列的多肽，其中：(a)所述氨基酸序列与SEQIDNO:5具有至少k%序列同一性，和/或包含SEQIDNO:5的片段；但(b)所述氨基酸序列在以下残基中的一个或多个处不同于SEQIDNO:5：S32、V33、L39、L41、F69、V100、I113、F122、L123、V124、S125、G126、L127、G128、S151、H239和/或E240。当特征(a)涉及片段时，所述片段将包括(b)中列出的残基中的至少一个，但当与SEQIDNO:5中的该残基相比时，该残基将不同。(a)的片段将通常为至少7个氨基酸长，例如来自SEQIDNO:5的8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、24、26、28、40、45、50、55、60个或更多个连续氨基酸。所述片段将通常包括来自SEQIDNO:5的至少一个表位。对于fHbp确立了表位鉴定和作图[11；27-31]。与SEQIDNO:5共享至少30个连续氨基酸将是典型的，并且通常突变体fHbpv2氨基酸序列将包括来自SEQIDNO:5的几个(例如2、3、4、5个或更多个)片段。总体而言，突变体fHbpv2氨基酸序列可以与SEQIDNO:5具有至少k%序列同一性且包括SEQIDNO:5的几个片段。k的值可以选自80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更高。其优选为90(即，突变体fHbpv2氨基酸序列与SEQIDNO:5具有至少90％同一性)且更优选为95。施用于宿主动物之后，所述多肽可以引发可以识别由SEQIDNO:4组成的野生型脑膜炎球菌多肽的抗体。这些抗体理想地是杀细菌的(参见下文)。这些抗体可以包括不识别v1或v3多肽(例如，由SEQIDNO:46组成的野生型脑膜炎球菌多肽和由SEQIDNO:40组成的野生型脑膜炎球菌多肽)的一些抗体，尽管它们还可以包括与v1和/或v3多肽交叉反应的一些抗体。在相同实验条件下，所述多肽具有比相同多肽更高的稳定性，但(b本文档来自技高网...

【技术保护点】
突变体v3或v2 fHbp，其为：(A)包含突变体fHbp v2氨基酸序列的多肽，其中：(a)所述氨基酸序列与SEQ ID NO:5具有至少80%序列同一性，和/或包含SEQ ID NO:5的至少7个氨基酸长且含有来自SEQ ID NO:5的S32的片段；但(b)所述氨基酸序列在残基S32处不同于SEQ ID NO:5，条件是如果突变体fHbp v2氨基酸序列包括仅残基32处的取代，则该取代不是被丙氨酸取代，或以下残基中的至少一个被取代；V33、L39、L41、F69、V100、I113、F122、L123、V124、S125、G126、L127、G128、S151、H239和/或E240；或者(B)包含突变体fHbp v3氨基酸序列的多肽，其中：(a)所述氨基酸序列与SEQ ID NO:17具有至少80%序列同一性，和/或包含SEQ ID NO:17的至少7个氨基酸长且含有来自SEQ ID NO:17的S32的片段；但(b)所述氨基酸序列在残基S32处不同于SEQ ID NO:17，条件是如果突变体fHbp v3氨基酸序列包括仅残基32处的取代，则该取代不是被丙氨酸取代，或以下残基中的至少一个被取代；I33、L39、L41、F72、V103、T116、F125、L126、V127、S128、G129、L130、G131、S154、H242和/或E243。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.28 EP 14157399.8;2014.07.17 EP 14177566.81.突变体v3或v2fHbp，其为：(A)包含突变体fHbpv2氨基酸序列的多肽，其中：(a)所述氨基酸序列与SEQIDNO:5具有至少80%序列同一性，和/或包含SEQIDNO:5的至少7个氨基酸长且含有来自SEQIDNO:5的S32的片段；但(b)所述氨基酸序列在残基S32处不同于SEQIDNO:5，条件是如果突变体fHbpv2氨基酸序列包括仅残基32处的取代，则该取代不是被丙氨酸取代，或以下残基中的至少一个被取代；V33、L39、L41、F69、V100、I113、F122、L123、V124、S125、G126、L127、G128、S151、H239和/或E240；或者(B)包含突变体fHbpv3氨基酸序列的多肽，其中：(a)所述氨基酸序列与SEQIDNO:17具有至少80%序列同一性，和/或包含SEQIDNO:17的至少7个氨基酸长且含有来自SEQIDNO:17的S32的片段；但(b)所述氨基酸序列在残基S32处不同于SEQIDNO:17，条件是如果突变体fHbpv3氨基酸序列包括仅残基32处的取代，则该取代不是被丙氨酸取代，或以下残基中的至少一个被取代；I33、L39、L41、F72、V103、T116、F125、L126、V127、S128、G129、L130、G131、S154、H242和/或E243。2.权利要求1的多肽，其中：(A)所述氨基酸序列与SEQIDNO:5的不同在于S32和以下中的一个或多个处的取代：V33、L39、L41、F69、V100、I113、F122、L123、V124、S125、G126、L127、G128、S151、H239和/或E240；例如，其中所述取代选自：S32V；V33C；L39C；L41C；F69C；V100T；I113S；F122C；L123R；V124I；S125G或S125T；G126D；L127I；G128A；S151C；H239R；E240H；或(B)所述氨基酸序列与SEQIDNO:17的不同在于S32和以下中的一个或多个处的取代：I33、L39、L41、F72、V103、T116、F125、L126、V127、S128、G129、L130、G131、S154、H242和/或E243；例如，其中所述取代选自：S32V；I33C；L39C；L41C；F72C；V103T；T116S；F125C；L126R；V127I；S128GorS128T；G129D；L130I；G131A；S154C；H242R；和E243H。3.权利要求1(A)的多肽，其包含多个残基处的取代，其中所述多个残基选自如下组2B、2I、2J或2O：2B：残基32和123；2I：残基32和125；2J：残基32、123和125；或2O：残基32、123、124、125、126、127和128。4.权利要求3的多肽，其包含相对于SEQIDNO:5的取代S32V和L123R，任选地进一步包含取代V124I、S125G、G126D、L127I、G128A；例如，包含SEQIDNO:20或SEQIDNO:45或SEQIDNO:58。5.权利要求1(B)的多肽，其包含多个残基处的取代，其中所述多个残基选自如下组3B、3I、3J或3O：3B：残基32和126；3I：残基32和128；3J：残基32、126和128；或3O：残基32、126、127、128、129、130和131。6.权利要求5的多肽，其包含相对于SEQIDNO:17的取代S32V和L126R，任选地进一步包含取代V127I、S128G、G129D、L130I、G131A；例如，包含SEQIDNO:44或SEQIDNO:61。7.任一前述权利要求的多肽，其还包括破坏所述多肽结合至人因子H的能力的一个或多个进一步突变；例如，在v2中，包括在残基R73、D203、E210...

【专利技术属性】
技术研发人员：M博托姆莱，E马利托，M马丁内利，M斯卡尔塞利，
申请(专利权)人：葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司，
类型：发明
国别省市：比利时;BE