本发明专利技术公开了一组特异识别化脓性链球菌的寡核苷酸适配子，属于食品卫生、临床医学检测领域。针对现有技术中尚无化脓性链球菌寡核苷酸适配子的缺陷，本发明专利技术通过竞争SELEX技术结合化脓性链球菌，经过12轮反复的孵育、清洗、解离、扩增、λ核酸外切酶消化制备单链次库，从一个单链DNA随机文库中筛选出了能与化脓性链球菌特异性结合的寡核苷酸适配子，经过测序、亲和力和特异性分析，获得3条效果最好的适配子，其核苷酸序列选自序列表中1～3。该组寡核苷酸适配子为分析检测食品卫生、临床血样中化脓性链球菌提供了一种特异高效的识别配体，为开发替代现有依赖抗体检测化脓性链球菌的方法提供了新的选择。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别涉及到利用分子生物学技术中的SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)制备一种与化脓性链球菌高特异性和高亲和力结合的核酸适配子，为该核酸适配子在检测化脓性链球菌中的应用提供科学依据和理论基础。
技术介绍
化胺性链球菌菌(Streptococcus pyogenes)又称A族链球菌(Group A ofStrept0C0CCuS，GAS)，属革兰氏阳性菌，是人类细菌感染中最重要的致病菌之一。在链球菌感染的疾病中90%左右是由化脓性链球菌引起的，能通过直接接触和呼吸道传播。它能引 起坏死性筋膜炎、咽炎、链球菌毒素休克综合症等，其感染后的变态反应性疾病更是危害重大。从20世纪80年代开始，严重的化脓性链球菌感染在全球范围内呈现大幅增长的趋势。因此，如何快速、准确检测化脓性链球菌具有重要研究意义。传统检测病原菌的方法往往是需要先分离病原微生物，然后通过微生物培养，再用经典的方法鉴定。耗时、不灵敏是这些方法普遍存在的问题。因此发展快速、灵敏检测病原微生物的技术十分必要。利用抗体虽然能够特异识别病原细菌，能够迅速、准确的对待检标本作出鉴定，但该技术受特异性抗体制备难度的制约。因为按照伯杰分类标准，生物学形状基本相同的细菌群体构成一个菌种，性状相近关系密切的若干菌种组成一个菌属。从本质上讲，同一菌属所含的表面抗原绝大多数是相同的，只有细微的差别，找到这些差别并制备相应特异性抗体显然是一项耗时而艰巨的任务。近些年来，寡核苷酸适配子作为抗体分子的前景性替代分子，其研究较为引人注目。寡核苷酸适配子是通过SELEX过程筛选的与靶物质特异性结合的一簇小分子DNA或RNA片段。SELEX技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,系统进化指数富集技术)是20世纪90年代初研制的一种新的组合化学技术，是一种研究核酸结构和功能的有效方法。其基本原理是体外化学合成一个随机单链寡核苷酸库，用它与靶物质混合，形成靶物质-核酸复合物，洗去未与靶物质结合的核酸分子，分离与靶物质结合的核酸分子，以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进行下轮的筛选过程。通过数轮重复筛选与扩增，最后得到高亲和力和高特异性的寡核苷酸适配子，即aptamer。利用SELEX技术筛选获得的aptamer识别分子的模式与蛋白抗体类似，但与蛋白类抗体相比，适配子具有更明显的优越性，如不依赖动物细胞，不受免疫条件和免疫原性限制，适配子的筛选完全在体外进行，具有时间、质量和数量上的选择弹性，可以在合成时精确、定点、随意连接其他功能基团和分子；适配子变性与复性可逆且速度快，可反复使用、长期保存和室温运输；靶分子范围更广，除蛋白质、核苷酸大分子外，还有小分子(如染料、可卡因、咖啡因和茶碱等)、生长因子、肽链、类固醇、糖类、辅因子(如FMN等)，甚至可用于完整的细胞、病毒、孢子等；与靶分子结合具有更强的特异性和亲和力，不受组织或样品中非靶蛋白的干扰，可以在靶目标性质未知的情况下筛选出其相应的适配子；适配子通过占据靶物质表位，使疾病得到控制，作为临床药物的治疗，已显现了潜在的应用前景，已有研究通过SELEX技术筛选到相应靶物质的适配子作为拮抗剂，抑制肿瘤生长时的血管内皮生长因子、血栓生成因子、一些毒素蛋白等的作用，以达到治疗目的。在微生物检测方面，特别是对一些致病性细菌或病毒的研究，虽然不知道其内部结构、功能及这些物质的表位，但将其作为靶物质，通过SELEX过程筛选到与其对应的适配子，检测靶物质，已成为该领域的研究探索热点。本专利技术以临床上常见的化脓性链球菌为靶标，利用SELEX技术获得了与化脓性链球菌特异性结合的核酸适配子序列，该序列可以快速、准确检测化脓性链球菌，由于单链DNA寡核苷酸适配子性能稳定、合成方便且廉价、经修饰后可直接用于荧光或化学发光、发色方法检测靶细菌，因此操作简单、直接。该专利技术可以在临床医学等领域得到广泛应用。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种微生物分子生物学检测方法，特别涉及一种利用适配子技术快速、准确检测化脓性链球菌的方法。 本专利技术方法利用指数级富集配体的系统进化技术(SELEX技术)，以化脓性链球菌完整的菌细胞为靶标，筛选获得与靶细胞高亲和性、高特异结合的适配子，通过羧基荧光素(FAM)标记方法将获得的适配子转为报告适配子，用于从临床血、食品培养上清中检测到相应的靶细菌，达到快速、准确诊断的目的。本专利技术的优点(I)与蛋白类的抗体相比，单链寡核苷酸更为稳定；aptamer可直接体外合成、标记，不需要标记的二抗，使得操作更为简单、迅速；aptamer的合成成本较抗体制备成本低，周期短。(2)该序列是从结构显著、与靶细菌具有不同亲和力的7条适配子序列中选取出的亲和力和特异性均最强的适配子序列，能够特异识别化脓性链球菌。附图说明图1是3A、5A及6A寡核苷酸适配子的饱和结合曲线图；图2是3A、5A及6A寡核苷酸适配子的二级结构分析图；图3是化脓性链球菌适配子与五种对照细菌的结合率表I是7个家族代表序列的解离常数Kd值具体实施例方式以下结合说明书附图和实施例对本专利技术作进一步的说明，但不是限制本专利技术。实施例1:化脓性链球菌特异性结合寡核苷酸适配子的竞争SELEX筛选1、体外化学合成初始随机单链DNA (ssDNA)文库及引物(由美国IntegratedDNATechnologies 公司完成)，序列如下5 ' -AGCAGCACAGAGGTCAGATG(40N)CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3';构建了长度为80nt的随机ssDNA文库，两端为固定引物序列，中间为40个碱基的随机序列，库容量为IO14以上；引物1:5' -AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3'；引物11:5' -TTCACGGTAGCACGCATAGG-3'；5'磷酸化下游引物5' -P-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3'；将随机ssDNA文库和两种引物均用TE缓冲液配制成100 μ M贮存液于_20°C贮存备用。2、PCR扩增条件及Lambda核酸外切酶消化制备单链次库的条件将合成的随机单链文库(ssDNA)稀释作为PCR模板扩增出磷酸化的双链DNA(dsDNA)产物，研究Lambda核酸外切酶消化磷酸化反义链制备单链次库的影响因素，最终确定制备单链次库的最佳条件。PCR反应体系为稀释随机文库作为模板DNA I μ L (IOOng)，上游引物及磷酸化下游引物(20 μ Μ)各 lyL，ClNTPniix (each 25 mM) I μ L，10XPCR 扩增缓冲液 5 μ L，灭菌超纯水40 μ L，Taq酶I μ L，总体积为50 μ L。PCR扩增程序95°C预变性5 min ;95°C变性30s ；58°C退火30s ;72°C延伸30s ;循环20次；最后72°C延伸lOmin。通过8%非变性PAGE验证扩增效果。·将电泳条带位置正确且单一的PCR扩增产物汇集在一个2mL离心管中，加入与PCR产物溶液等体积的酚氯仿异戊醇(V : V : V = 25 : 24 :1)，旋涡混匀管内容物使呈乳状，8000rpm, 4°C离心5min,将上层本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组特异识别化脓性链球菌的寡核苷酸适配子，其核苷酸序列为：1)序列表1～3所示的核苷酸序列；2)序列表1～3所示核苷酸序列经替换、缺失和/或者插入一个或几个核苷酸形成的具有同等功能的序列；或，3)含有序列表1～3所示核苷酸序列为核心序列并两边延长的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王周平，王鑫，段诺，吴世嘉，夏雨，马小媛，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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