细菌蛋白载体和缀合方法技术

本发明专利技术涉及多糖缀合物，其包含以下或由以下组成：与载体多肽缀合的一种或多种多糖，其中所述载体多肽选自：(a)化脓性链球菌SpyAD(Spy0269，GAS40)、化脓性链球菌SpyCEP(Spy0416，GAS57)或化脓性链球菌SLO(Spy0167，GAS25)；(b)CRM

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细菌蛋白载体和缀合方法
专利

[0001]本专利技术涉及来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(A群链球菌)的抗原用作载体蛋白的用途，连同改进的缀合方法以及所述缀合物用于预防和/或治疗疾病的用途。
[0002]专利技术背景
[0003]A群链球菌(GAS)引起多种疾病，从浅表感染(咽炎、皮肤感染、蜂窝组织炎)到严重的侵袭性疾病(产后败血症、坏死性筋膜炎、链球菌中毒性休克综合征)，其中在低收入和中等收入国家(LMIC)中具有高频的严重后遗症(急性风湿热、ARF；风湿性心脏病、RHD和肾小球肾炎)[1]。
[0004]咽炎是全世界儿童中最常见的症状性GAS感染，估计每年有超过4亿例[2]并且是抗生素使用的重要驱动因素[3]，其最终可能导致抗生素抗性增加，这是一场日益严重的公共卫生危机[4]。咽炎可能导致RHD，一种慢性炎性心脏瓣膜病况，其代表GAS的主要全球负担。在2015年，估计31.9万人死于RHD，其中RHD病例超过3300万且损失1000万伤残调整生命年(DALY)[5]。接种疫苗是长期减少全球GAS相关疾病负担的最实用策略。然而，目前还没有针对这种病原体的商业疫苗[6]。
[0005]A群碳水化合物(GAC)是一种表面多糖，其由聚鼠李糖骨架与侧链上交替的N
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乙酰葡糖胺(GlcNAc)构成。它代表了一种有吸引力的疫苗候选物，因为它高度保守并在GAS菌株中表达。实际上，疫苗策略开发的主要障碍之一由与其他非碳水化合物抗原相关的GAS血清型多样性代表[7]。<br/>[0006]多糖(PS)与适当的载体蛋白的缀合是提高其免疫原性的常用程序[8]。PS是典型的T
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细胞非依赖性抗原，其天然仅含有B
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细胞表位且缺乏T
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细胞表位。与作为T
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细胞表位的来源的蛋白的共价缀合将PS转化为T
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依赖性抗原，其在婴儿中具有增强的记忆应答、类别转换和抗体产生[9，10]。
[0007]已经报道，人抗GAC血清成功促进了几种GAS菌株的吞噬作用[11]，而用与破伤风类毒素(TT)或CRM
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载体蛋白缀合的GAC免疫的小鼠被保护免于GAS攻击[12，13]。此外，高抗GAC抗体滴度和墨西哥儿童喉咙中GAS的存在之间的反比关系得到证明[13]。
[0008]保守蛋白抗原也在针对GAS的疫苗开发中。具体而言，通过反向疫苗学方法，链球菌溶血素O(SLO)、SpyAD和SpyCEP被鉴定为有前途的疫苗候选物[14]。SLO通过防止细菌内化至溶酶体中已被显示为GAS的关键毒力因子，在溶酶体中细菌可以被破坏[15]。此外，SLO促进GAS对中性粒细胞的吞噬清除的抵抗力，促进GAS从先天免疫杀伤中逃逸，并且灭活的SLO表明在小鼠模型中针对GAS攻击是保护性的[16]。SpyAD是一种表面
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暴露的粘附素，其介导GAS与宿主细胞的相互作用。此外，GAS菌株中SpyAD基因的缺失导致敲除突变体正确分裂的能力受损，表明在细菌分裂中也具有重要作用[17]。最后，SpyCEP是一种多结构域蛋白酶，具有负责白介素(IL)
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8和其他趋化因子切割的催化结构域。IL
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8的切割代表了一种免疫逃避机制，防止IL
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8C
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末端介导的内皮易位和随后的中性粒细胞的募集[18，19]。
[0009]这三种蛋白抗原在临床收集物中高度保守和普遍，并且与GAC一起几乎可以覆盖所有GAS临床分离株[20]。因此，已经提出由重组SLO、SpyAD和SpyCEP与GAC
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CRM
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缀合物构
成的多组分疫苗的制剂[6]。
[0010]由于GAS的严重后遗症主要影响LMIC，因此需要尽可能降低生产成本，以使疫苗在经济上可行。
[0011]专利技术详述
[0012]在这里，测试了使用具有用于GAC的抗原和载体的双重作用的GAS蛋白之一的可能性，旨在降低最终疫苗制剂的复杂性。CRM
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是目前用于许可的针对细菌感染的糖缀合物疫苗中的少数载体蛋白之一。出于该原因，人们越来越担心预暴露或共同暴露于该载体可能导致免疫干扰和抗碳水化合物免疫应答的减少[9]，因此驱动鉴定替代载体蛋白的需要[21，22]。本专利技术人令人惊讶地发现SLO、SpyAD和SpyCEP各自都可用作PS的载体蛋白。
[0013]PS与载体蛋白的化学缀合是一个复杂的过程，如果不在稳健的条件下进行，其可能导致缺乏重现性和一致性。尽管CRM
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是众所周知的具有完全确立缀合条件的载体蛋白，但本专利技术人令人惊讶地发现，使用实验设计(DoE)方法，可以改进PS(诸如GAC)与CRM
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和GAS抗原的连接的稳健性和产率。
[0014]因此，本专利技术的第一个方面提供了多糖缀合物，其包含以下或由以下组成：与载体多肽缀合的一种或多种多糖，其中所述载体多肽为：
[0015](a)化脓性链球菌SpyAD(Spy0269，GAS40)、化脓性链球菌SpyCEP(Spy0416，GAS57)或化脓性链球菌SLO(Spy0167，GAS25)；
[0016](b)CRM
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；或
[0017](c)(a)或(b)的片段、变体和/或融合体。
[0018]通过使用GAS抗原作为载体蛋白，提供了CRM
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的替代物，消除了预先暴露或共同暴露于该载体可能导致免疫干扰和抗碳水化合物免疫应答降低的担忧。此外，使用GAS抗原作为载体多肽可能允许从提出的重组SLO、SpyAD和SpyCEP与GAC
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CRM
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缀合物的多组分疫苗制剂中除去CRM
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。这种简化将降低生产成本，使疫苗在经济上更可行，尤其是在利润空间较低的LMIC中。如果CRM
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保留在疫苗制剂中，则目前公开的缀合方法提供的增加的产率和稳健性将有助于降低生产成本，并因此提高LMIC中的商业可行性。
[0019]因此，在一个实施方案中，多糖缀合物是根据本专利技术的第十个方面的方法产生的(如下所述)。
[0020]可替代地或另外地，所述载体多肽为：
[0021](a)选自化脓性链球菌SpyAD(Spy0269，GAS40)、化脓性链球菌SpyCEP(Spy0416，GAS57)和化脓性链球菌SLO(Spy0167，GAS25)，或
[0022](b)(a)的变体、片段和/或融合体。
[0023]“与载体多肽缀合的一种或多种多糖”意指或包括(a)一种或多种多糖分子可以与载体多肽缀合；和/或(b)一种或多种分子种类的多糖可以与载体多肽(例如，相同属、种或菌株的不同多糖，或来自不同属、种或菌株的多糖)缀合。
[0024]“SpyAD(Spy02本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.氧化多糖的方法，所述方法包括氧化所述多糖的步骤，其包括以下步骤：I.通过如下氧化所述多糖：使所述多糖与i.氧化剂，ii在合适的缓冲液中，iii.在合适的温度下，iv.反应合适的时间。2.氧化多糖的方法，所述方法包括以下步骤：I.通过如下氧化多糖：i.使多糖，例如，浓度为0.1
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100mg/ml，例如，0.5
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50、0.5
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25、1
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10、2.5
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7.5、4
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6或5mg/mL的多糖，与ii.浓度为0.5
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10M的氧化剂(例如，NaIO4[高碘酸钠+、KMnO4[高锰酸钾]、高碘酸[HIO4]或四乙酸铅[Pb(OAc)4])，iii.在合适的缓冲液(例如，200mM磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液)pH 3
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9，例如，pH 5
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8(例如，pH 5或pH 8)中，iv.在合适的温度(例如，20
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30℃，诸如25℃)下，v.反应合适的时间(例如，15分钟
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5小时，诸如，30分钟
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3小时、30分钟
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1小时或30分钟)；II.(任选地)通过如下淬灭残余的NaIO4：vi.添加合适量的还原剂，例如，Na2SO3(亚硫酸钠)，例如相对于步骤I(ii)中NaIO4的浓度摩尔过量，例如步骤I(ii)中的NaIO4浓度的5
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10倍，或16mM，vii.在合适的温度(例如，20
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30℃、室温或25℃)下，viii.持续合适的时间(例如，10
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30分钟或15分钟)；III.(任选地)纯化和/或浓缩氧化的多糖，例如，使用选自冻干、离心蒸发、旋转蒸发和切向流过滤的方法。3.权利要求1或2的方法，其中所使用的多糖浓度、氧化剂、氧化剂浓度、合适的缓冲液、合适的温度和合适的时间中的至少一种确保所述方法实现所述多糖的至少5％、至少10％、至少15％、10％和30％之间、10％和25％之间或约15％的氧化。4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述多糖是GAC且所述方法中使用的多糖浓度、氧化剂、氧化剂浓度、合适的缓冲液、合适的温度和合适的时间中的至少一种确保所述方法实现至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、60％和100％之间、65％和100％之间、70％和90％之间或75％和90％之间的GAC回收率。5.缀合氧化的多糖的方法，所述方法包括以下步骤：a.使氧化的多糖与；b.载体多肽/蛋白；和c.氰基硼氢化钠；d.在硼酸盐缓冲液中；e.在合适的温度下；f.反应合适的时间。6.缀合氧化的多糖的方法，所述方法包括以下步骤：
A.a.使浓度为5
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75mg/mL(例如，40mg/mL)的氧化的多糖与；b.浓度为5
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75mg/mL(例如40mg/mL)的蛋白；和c.浓度为0.5
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10.0mg/ml的NaBH3CN(氰基硼氢化钠)；d.在pH 7
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9、例如pH 7.5
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8.5、pH8的硼酸盐缓冲液中；e.在合适的温度(例如，17.5
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42.5℃、室温、25℃、30℃或37℃)下，f.反应合适的时间(例如，1小时、2小时、4小时、6小时、0.5至3天、1天或2天；B.(任选地)通过如下淬灭氧化的多糖的残余醛：j.添加合适量的NaBH4(例如，NaBH4：多糖比[w/w]为0.5∶1，或例如相对于生成的醛基或氧化的多糖的摩尔数摩尔过量，例如，5
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10倍、50倍、100倍或1000倍)，k.在合适的温度(例如，20
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30℃、25℃或室温)下，l.持续合适的时间(例如，1至12小时、2
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4小时)。C.(任选地)通过切向流过滤(TFF)和/或无菌过滤(例如，TFF，随后无菌过滤)纯化由步骤(B)产生的多糖缀合物。7.权利要求5或6的方法，其中所述方法中使用的氧化的多糖浓度、载体多肽/蛋白浓度、氰基硼氢化钠浓度、硼酸盐缓冲液的pH和合适的温度中的至少一种确保所述方法实现至少0.25、至少0.3、至少0.35、至少0.4、0.25和1之间、0.3和0.8之间或0.4和0.8之间的多糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：F，
申请(专利权)人：葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司，
类型：发明
国别省市：