马蔺耐盐相关液泡膜H制造技术

本发明专利技术涉及马蔺耐盐相关液泡膜H

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程及遗传育种领域，具体地说，涉及马蔺耐盐相关液泡膜H+-PPsae基因及其编码蛋白与应用。
技术介绍
目前我国土壤盐渍化日益严重，已经严重影响到农作物的生产，导致农业生产力下降，增强植物耐盐性或改良土壤盐碱化已成为现阶段面临的主要问题。马蔺(IrislacteaPall.var.chinensis(Fisch.)Koidz.)是鸢尾科鸢尾属多年草本植物，主要分布于我国东北、西北、华北等地区的低地盐碱化草甸、荒漠草原草地、山坡荒野等，具有极强的抗旱耐盐性，并已成为退化盐化低地草甸的指示植物之一，因其叶色青绿，绿期长，花色淡雅美丽，管理粗放，已经成为城市园林景观配置和郊野公园绿地建设的优良地被植物。大量研究表明，造成植物的生理干旱的原因是土壤中钠离子浓度过高，破坏了细胞的离子平衡，细胞膜的功能和代谢活动都将受到抑制，严重的可导致细胞死亡，而Na+外排和区域化是植物细胞抵御Na+毒害的主要策略。细胞质中过多Na+将区域化到液泡中，H+-ATPase和H+-PPase共同构成的液泡膜质子泵能形成H+跨膜电化学梯度，为液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的功能的实现提供驱动力，降低Na+对细胞质中代谢酶的损害，维持细胞膨压，最终提高植物的抗旱耐盐能力。与液泡膜H+-ATPase相比，H+-PPase仅由单基因编码，且在建立跨膜电化学势梯度上的作用与H+-ATPase相当，甚至贡献更大，因此对H+-PPase的研究更具现实意义。据报道，已从拟南芥(Arabidopsisthaliana)、大麦(Hordeumvulgare)、甜菜(Betavalgaris)、水稻(Oryzasativa)、梭梭(Haloxylonammodendron)等诸多植物中克隆得到H+-PPsae基因。H+-PPase的活性通常被高浓度的Na+抑制，而低浓度的Na+反而会提高其转录水平。植物种类、器官类型、发育状态以及盐溶液中的Na+浓度影响着植物液泡膜H+-PPase活性或转录水平的变化。在对胡萝卜(Daucuscarota)、向日葵(Helianthusannuus)、大麦等植物H+-PPase对盐胁迫响应的研究表明，在不同NaCl处理条件下，H+-PPase活性均比对照高，表明NaCl可诱导H+-PPase活性上升。而大麦经200mMNaCl处理后，根部H+-PPase活性比对照降低一倍。此外，NaCl对H+-PPase的抑制作用可被外源Ca2+缓解，降低细胞内Na+、Cl-含量和K+外渗，抑制Na+吸收是Ca2+缓解盐害的作用机理之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供马蔺耐盐相关液泡膜H+-PPsae基因及其编码蛋白。本专利技术的另一目的是提供马蔺耐盐相关液泡膜H+-PPsae基因的应用，该基因可用于农作物和优良牧草的耐盐抗旱遗传改良。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供的马蔺耐盐相关液泡膜H+-PPsae基因IlVP，所述基因IlVP的cDNA序列为：i)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或ii)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与SEQIDNO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。所述马蔺耐盐相关液泡膜H+-PPsae基因IlVP编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术还提供含有所述基因IlVP的表达盒。本专利技术还提供含有所述基因IlVP或所述表达盒的载体。本专利技术还提供含有所述基因IlVP、所述表达盒或所述载体的工程菌、转基因细胞系。携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(Weissbach，1998，MethodforPlantMolecularBiologyVIII，AcademyPress，NewYork，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，PlantMolecularBiology，2ndEdition)。本专利技术还提供所述基因IlVP在提高植物(例如烟草、拟南芥等)耐盐性中的应用。在本专利技术的一个具体实施方式中，采用农杆菌介导的方法，将含有所述基因IlVP的载体转入烟草中，转化后的材料经过共培养-筛选-分化-转基因苗的锻炼和移栽，筛选过表达基因IlVP的转基因烟草。优选地，所用出发载体为植物表达载体pBI121。本专利技术还提供所述基因IlVP在制备转基因植物中的应用。本专利技术进一步提供所述基因IlVP在植物抗逆遗传改良中的应用。本专利技术首次从耐盐性较强的马蔺中克隆获得耐盐相关液泡膜H+-PPsae基因IlVP，并将该基因导入烟草，使烟草的耐盐性得到明显提高。本专利技术的耐盐基因IlVP为农作物和优良牧草的耐盐遗传改良和新品种选育提供重要的科学理论依据。附图说明图1为本专利技术实施例1中马蔺耐盐相关基因IlVP的cDNA克隆结果。以马蔺cDNA为模板，PCR扩增核心区、3’端、5’端、ORF片段。M1：DL2000；1：核心片段；2:3’端片段；3:5’端片段；4-5：ORF片段。图2为本专利技术实施例1中马蔺IlVP基因cDNA核酸序列及其推测的氨基酸序列。左侧的数字分别代表核苷酸和氨基酸的位点，阴影处为起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)以及三个保守片段。图3为本专利技术实施例1中马蔺基因IlVP编码蛋白的跨膜区结构。图4为本专利技术实施例1中马蔺基因IlVP与海枣PdVP、水稻OsVP及拟南芥AtVP氨基酸的多重比对结果。图5为本专利技术实施例2中盐胁迫下马蔺基因IlVP表达模式的分析结果。(a)：RealtimePCR分析200mMNaCl处理马蔺幼苗24h基因IlVP在地上部和根中的表达模式；(b):在0，25，50，100，200mMNaCl分别处理0、6、12、24和48h后对幼苗地上部IlVP基因表达水平的影响。图中每个点均代表平均值±标准误(n＝3)，Actin为内参。图6为本专利技术实施例3中植物表达载体pBI121-IlVP的质粒图谱。图7为本专利技术实施例3中转IlVP基因烟草的制备及鉴定。a：叶盘预培养；b：叶片边缘膨大；c：愈伤组织分化；d：抗性芽培养；e：抗性苗生长；f：抗性植株。图8为本专利技术实施例3中转IlVP基因阳性烟草植株的鉴定结果。A：转基因烟草基因组DNAPCR检测；B：转基因烟草植株SouthernBlot杂交鉴定；C：转基因烟草植株NorthernBlot杂交鉴定。图9为本专利技术实施例3中转IlVP基因烟草耐盐性鉴定结果。A：盐胁迫7d后对野生型与转基因烟草生长情况的影响(WT：野生型烟草，T：转基因烟草)；B：盐胁迫7d后对野生型与转基因烟草生长状况及根、茎、叶中Na+(a)、K+(b)、Ca2+(c)变化的影响；C：NaCl胁迫处理7d对野生型和转基因烟草植株根、茎、叶的鲜重(a)和干重(b)的影响；D：NaCl胁迫处理7d对野生型和转基因烟草叶本文档来自技高网...

【技术保护点】
马蔺耐盐相关液泡膜H+‑PPsae基因IlVP，其特征在于，所述基因IlVP的cDNA序列为：i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.马蔺耐盐相关液泡膜H+-PPsae基因IlVP，其特征在于，所述基因IlVP的cDNA序列为：i)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或ii)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与SEQIDNO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。2.权利要求1所述基因IlVP编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如S...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟林，李杉杉，郭强，毛培春，田小霞，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京;11