一种体外重组的屏障缺陷表皮模型及构建方法技术

本发明专利技术涉及一种体外重组的屏障缺陷表皮模型及其构建方法,该缺陷模型在转染成功的表皮细胞中，兜甲蛋白基因水平的表达量为正常细胞的40％；用该细胞构建的模型，兜甲蛋白含量下降为正常模型的35％；该缺陷模型与正常模型相比，模型厚度为正常模型的60％；活细胞层数为3-4层；模型活力测定OD值维持在0.8-1.0。该屏障缺陷表皮模型的构建方法,包括兜甲蛋白基因缺陷表达的表皮细胞的制备、缺陷培养基的制备及屏障缺陷表皮模型的三维培养。本发明专利技术应用RNA干扰技术构建屏障缺陷的表皮替代模型，对于开发屏障修复性化妆品及化妆品功效性验证有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种体外重组的屏障缺陷表皮模型及构建方法
本专利技术属于生物医学领域，涉及一种体外重组的屏障缺陷表皮模型及构建方法。
技术介绍
随着体外科学的发展，体外皮肤替代模型的开发与利用取得突破性进展。目前国外已有Epiderm、Episkin两款表皮皮肤替代模型研发成功，并被多家实验室和化妆品公司购买用于化妆品皮肤安全性评价测试。近年来，随着消费者对化妆品功效重视度的提高，皮肤模型不再用于单一的安全性评价，功效性验证成为未来的发展方向。与安全性评价相比，功效性验证对皮肤模型的要求更为严格，它更注重于模型与问题肌肤的真实拟合度。随着年龄的变化及环境因素的影响，人体肌肤的屏障功能逐渐下降，各种肌肤问题也会逐渐显现。导致皮肤屏障功能下降的因素有很多，最主要原因是表皮细胞增殖分化平衡逐渐被打破，屏障相关膜套蛋白表达量发生改变，如LOR蛋白的含量随着年龄的升高，显著下降等。现有商品化的表皮模型都是模拟健康皮肤构建而成，模型的屏障功能较强，用于功效性评价，难以做到真实、客观。因此，开发新的屏障功能缺陷的体外皮肤模型更为重要。皮肤角质层是人体发挥自身屏障，抵御外界环境的主战场。角质层独特的“砖灰”结构是屏障的基石。三大脂类物质(神经酰胺、胆固醇、脂肪酸)与角质细胞膜套蛋白交联共同构建了砖灰结构。已有研究证明，角质层膜套蛋白的主要成分是兜甲蛋白(Loricrin)，其含量占膜套蛋白总含量的80％以上。并且，随着年龄的增加，人体皮肤屏障功能逐渐降低，角质层细胞形态发生变化，兜甲蛋白含量也逐步降低，间接说明兜甲蛋白对人体屏障功能的发挥，具有重要作用。基于此，如果通过分子生物学方法如(RNA干扰技术)缺陷兜甲蛋白基因(LOR)的表达，同时改变模型培养液中表皮生长因子与钙离子的浓度，模拟老化皮肤增殖分化的类似环境，达到实现构建表皮屏障功能缺陷模型的目的。表皮生长因子(EGF)通过与细胞表面的受体结合，激活受体内在的酪氨酸激酶的活性，启动信号级联反应，促进DNA合成和细胞的增殖。表皮钙离子从基底层到颗粒层依次形成梯度，在颗粒层上层达到最高水平(1.5mmol/L)。钙离子的浓度直接影响表皮细胞分化相关标记(marker)的表达，对被膜颗粒中脂质的有序运输及屏障相关的蛋白的有序稳定表达至关重要。RNA干扰技术(RNAinterference，缩写为RNAi)指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。传统的RNA干扰方法是向细胞内转染短的双链RNA分子(double-standedRNA,dsRNA)，但在实际应用中，存在稳定性差、可能改变其他基因正常表达等缺陷。StealthTMRNAi是新一代的RNA干涉分子，具有更高的特异性和稳定性。其主要流程是：1、引物设计与合成：设计3条StealthTMsiRNA和1条阴性对照(设立阴性对照的目的是用来检测RNAi的特异性。阴性对照，也称为“零乱”siRNA(scrambledsiRNA)，是在打乱特异性siRNA序列基础上设计的)，并由引物设计公司进行合成。2、将核酸导入细胞，实现转染；3、检测筛选对LOR基因有显著抑制的表皮细胞。在此基础上利用缺陷的表皮细胞进行模型构建，同时通过调节模型生发阶段关键因子的浓度，模拟问题肌肤微环境，构建屏障缺陷表皮皮肤模型，用于化妆品功效性检测。截止目前，曾有国外学者利用RNA干扰技术，缺陷表皮细胞保湿相关丝聚蛋白基因(FLG)的表达，构建有保湿缺陷的表皮模型。本专利技术所构建的缺陷模型与该模型相比，更接近于问题肌肤状态，对于开发屏障修复性化妆品及化妆品功效性验证更有意义。与本文类似的通过改变LOR基因的表达构建屏障缺陷的表皮模型,尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是应用RNA干扰技术，构建靶向兜甲蛋白基因(LOR)的StealthTMRNA，转染人表皮细胞，在转染验证成功的基础上，选择含有缺陷LOR基因的表皮细胞构建表皮模型，同时通过改变表皮培养液中生长因子(EGF)及钙离子的浓度，调节模型增殖分化平衡，从而构建体外重组的屏障缺陷表皮模型，适用于化妆品功效性验证试验。本专利技术是这样实现的：本专利技术所提出的体外重组的屏障缺陷表皮模型，其特点在于：兜甲蛋白基因水平的表达在转染成功的表皮细胞中，明显降低—表达量为正常细胞的40％；用该细胞构建的模型兜甲蛋白含量明显下降—表达量为正常细胞的35％。模型形态学结构方面，缺陷模型与正常模型相比，模型厚度变薄—为正常模型厚度的60％；活细胞层数变少—为3-4层。模型活力测定OD值为0.8～1.0(正常模型OD值在1.0～2.5之间)。用缺陷模型与正常模型同时进行阳性物功效验证实验，结果显示缺陷模型对活性物的作用效果更为敏感，模型给药前后形态学差异更为显著。本专利技术含有缺陷屏障的表皮皮肤模型的制备方法，包括兜甲蛋白基因缺陷表达的表皮细胞的制备、缺陷培养基的制备及屏障缺陷表皮模型的三维培养，具体步骤如下：一.兜甲蛋白基因缺陷表达的表皮细胞的制备步骤一、RNA干涉分子(StealthTMRNA)的设计与合成：本专利技术人根据LOR基因序列(GeneBank号NM_000427)，遵循EIbashir的siRNA序列设计原则，采用siRNA设计软件设计3条siRNAs和一条scramble对照。设计3条siRNAs的目的是通过增加平行试验以期提高试验的成功率。本次实验设计的三段siRNA位点基本上分散于mRNA的全长上，目的是分散设计可以减少实验失败的风险。本步骤设计的StealthTMRNA,由Invitrogen公司代为合成。3条siRNA和scrambled对照的具体序列如下表所示：表1.siRNA序列列表步骤二、RNA干涉分子(StealthTMRNA)的细胞转染及转染后鉴定分析：本步骤中所选用的表皮细胞取自有细胞库中冻存的表皮第二代细胞，复苏后，传代至第4代或第5代备用。复苏后传一至两代的目的是提高表皮细胞的稳定性和均一性。随后，按照转染试剂盒LipofectamineTM2000Reagent(Invitrogen公司生产)的操作方法，进行转染前试剂准备工作和转染操作，具体步骤如下：(1)表皮细胞接种：按照1×104-1.5×104个细胞/cm2的接种密度接种细胞，37℃，CO2培养箱培养24-48小时，待细胞铺板率达到30～50％时进行转染。由于基因阻断的分析时间是转染后24-72小时，选择在细胞铺板率处于低密度时转染，可以延长转染和分析之间的间隙，从而避免由于培养时间过长造成的细胞过度生长、细胞老化等现象的出现。(2)转染液的制备及细胞转染：在转染操作前，根据试剂盒说明书制备转染液。转染液制备具体步骤及孔板每孔转染试剂具体用量如下：①稀释2000Regent：使用前遵照说明书，轻摇混匀2000Regent，然后吸取6-15μ2000Regent在150μL低血清培养基中稀释待用(2000Regent的用量可根据细胞及密度进行调节)。②稀释siRNA：根据siRNA的制备浓度，吸取总量为14μg的siRNA于700μL低血清培养基稀释待用。③脂质体-siRNA混合物的制备：各吸取步骤①和②配置的液体150μL,按照体积比1:1，混匀，室温静置5分钟。④细胞转染：按照每孔250μL的加样量将步骤③配置的脂质体-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外重组的屏障缺陷表皮模型,其特征在于：在转染成功的表皮细胞中，兜甲蛋白基因水平的表达量为正常细胞的40％；用该细胞构建的模型，兜甲蛋白含量下降为正常模型的35％；该缺陷模型与正常模型相比，模型厚度为正常模型的60％；活细胞层数为3‑4层；模型活力测定OD值维持在0.8‑‑‑1.0。

【技术特征摘要】
1.一种体外重组的屏障缺陷表皮模型,其特征在于：使用兜甲蛋白基因的siRNA转染表皮细胞，在转染成功的表皮细胞中，兜甲蛋白基因水平的表达量为正常细胞的40％；用该细胞构建的模型，兜甲蛋白含量下降为正常模型的35％；该缺陷模型与正常模型相比，模型厚度为正常模型的60％；活细胞层数为3-4层；模型活力测定OD值维持在0.8---1.0，所述体外重组的屏障缺陷表皮模型的构建方法为：先将转染成功的表皮细胞进行液下培养，然后再进行气液面培养，模型总计培养周期为10d；所述siRNA的序列为GGCTCTCCTTCCTTCTCAGACAAGA；液下培养液的主要成分及含量为：基础培养液FAD1L,氢化可的松0.4-0.6μg/mL，胰岛素1-1.5μg/mL，腺嘌呤2.2-2.4μg/mL，EGF0.05-0.15ng/mL；气液面培养液的主要成分及含量如下：基础液FAD1L，氯化钙0.47-0.6mmol/L，氢化可的松0.2-0.4μg/mL，胰岛素1-1.5μg/mL，腺嘌呤2.2-2.4μg/mL，VC20-30ng/mL。2.一种体外重组的屏障缺陷表皮模型的构建方法,其特征在于,包括兜甲蛋白基因缺陷表达的表皮细胞的制备、缺陷培养基的制备及屏障缺陷模型的三维培养，具体方法步骤如下：兜甲蛋白基因缺陷表达的表皮细胞的制备步骤一、RNA干涉分子Stealth™RNA的设计与合成：根据LOR基因序列GenBank号NM_000427，遵循EIbashir的siRNA序列设计原则，采用siRNA设计软件设计3条siRNAs和一条scramble对照；步骤二、RNA干涉分子Stealth™RNA的细胞转染及转染后鉴定分析：本步骤中所选用的表皮细胞取自有细胞库中冻存的表皮第二代细胞，复苏后，传代至第4代或第5代备用，随后，进行转染前试剂准备工作和转染操作，具体步骤如下：表皮细胞接种：按照1×104-1.5×104个细胞/cm2的接种密度接种细胞，37℃，CO2培养箱培养24-48小时，待细胞铺板率达到30~50%时进行转染；转染液的制备及细胞转染：在转染操作前，根据试剂盒说明书制备转染液；转染液制备具体步骤及孔板每孔转染试剂,具体用量如下：①稀释Li...

【专利技术属性】
技术研发人员：张艳云，卢永波，
申请(专利权)人：陕西博溪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61