一种多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统及其制备方法技术方案

本发明专利技术属生物技术领域，涉及一种狂犬病毒糖蛋白衍生多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统及其制备方法。本发明专利技术采用狂犬病毒糖蛋白衍生肽RVG29作为脑靶向头基，阳离子树枝状大分子为载体材料，通过亲水性聚合物连接RVG29多肽构建脑靶向载体；脑靶向载体再通过静电复合作用与编码特定基因的质粒DNA复合，制成所述的脑靶向纳米基因递释系统。本发明专利技术能增加纳米基因递释系统在体外血脑屏障模型的摄取和穿过效率，提高纳米基因递释系统在动物脑内的蓄积，提高报告基因在脑内的表达量，实现基因跨过血脑屏障向脑内的递释，为诊断和治疗基因的脑部应用提供了一种高效和安全的策略。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术 属生物
，涉及一种多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统，具体涉及一种狂犬病毒糖蛋白衍生多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统及其制备方法。
技术介绍
研究显示，血脑屏障的存在对于维持中枢神经系统的稳态有着至关重要的作用，但同时，其也阻碍了诊断或治疗药物向脑内的有效递送。现代医学研究证实，血脑屏障的主要成分是脑毛细血管内皮细胞，其特点是细胞间有致密的紧密连接，绝大多数物质难以通过；而另外一方面，一些内源性的蛋白等营养物质可通过结合特定受体，利用受体介导的穿细胞作用，跨过血脑屏障，到达脑内；此外，一些病原体如狂犬病毒也可通过特定的受体，跨过血脑屏障，引起脑内感染。有研究发现，一种由狂犬病毒糖蛋白衍生的29个氨基酸的多肽RVG29保留了与血脑屏障上特异受体结合的特性，因此采用RVG29多肽修饰药物递释系统，可实现高效的脑靶向递释；并且由于神经元细胞也表达有特异性的受体，RVG29修饰的药物递释系统跨过血脑屏障后，将有利于进一步靶向神经元，对于治疗神经系统疾病如神经退行性疾病等有重要意义。聚酰胺胺树枝状分子(PAMAM)是近年来发展应用的一类新型阳离子树枝状聚合物大分子，其特征为纳米级的尺寸，表面有丰富氨基，一方面有利于进行进一步的修饰，另一方面由于其在生理条件下带有正点荷，可与负电性的质粒DNA复合，通过静电相互作用自组装成载基因纳米粒，起到保护质粒DNA在循环过程中不被酶类降解。有研究表明，通过亲水性聚合物可将阳离子树枝状大分子与脑靶向多肽进行连接，同时亲水性聚合物也可延长载基因纳米粒在体内的循环时间，减少网状内皮系统的非特异性摄取，减少非靶组织的摄取，进而降低给药系统的副作用。但目前脑部基因递释存在的种种局限，现急需一种新型的脑靶向纳米基因递释系统，该递释系统可增加纳米基因递释系统在体外血脑屏障模型的摄取和穿过效率，提闻纳米基因递释系统在动物脑内的畜积，进而提闻报告基因在脑内的表达量，实现基因跨过血脑屏障向脑内的递释。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统，尤其是一种狂犬病毒糖蛋白衍生多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统及其制备方法。本专利技术的递释系统为一种新型的狂犬病毒糖蛋白衍生肽RVG29修饰的阳离子树枝状大分子包载基因的脑靶向纳米基因递释系统。本专利技术利用阳离子树枝状大分子材料的高度分枝特性，在其表面进行聚乙二醇PEG化修饰，既作为连接剂，利于后续靶向多肽的修饰，也可中和阳离子树枝状大分子表面的正电性，以降低其毒性，延长基因递释系统在体内的循环时间，同时使用极具临床应用潜力的脑靶向头基——RVG29多肽修饰阳离子树状大分子材料，增加纳米基因递释系统在体外血脑屏障|旲型的摄取和穿过效率，提闻纳米基因递释系统在动物脑内的畜积，进而提闻报告基因在脑内的表达量，实现基因跨过血脑屏障向脑内的递释。具体而言，本专利技术的一种多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统，其特征在于，由脑靶向载体和编码特定基因的质粒DNA构成，所述的脑靶向载体由阳离子树状大分子材料、亲水性聚合物和RVG29组成。本专利技术中，采用狂犬病毒糖蛋白衍生肽RVG29作为脑靶向头基，阳离子树枝状大分子为载体材料，通过亲水性聚合物连接RVG29多肽构建新型脑靶向载体；所述的脑靶向载体再进一步通过静电复合作用与编码特定基因的质粒DNA复合，制成脑靶向纳米基因递释系统。其中，所述的脑靶向载体为RVG29修饰的树枝状大分子脑靶向载体，是以阳离子树枝状大分子材料、亲水性聚合物和RVG29多肽为组分，三者以共价方式连接制成；所述的亲水性聚合物与阳离子树状大分子材料的分子比是I 20 I ；所述的RVG29多肽与阳离子树状大分子材料的分子比为I 10 : I ;所述的脑靶向载体与质粒DNA复合的质量之比是3 10 I ；所述的狂犬病毒糖蛋白衍生肽RVG29多肽(YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)，具有SEQ ID NO. I的序列。本专利技术中，所述的脑靶向载体通过下述方法制备阳离子树枝状大分子材料和亲水性聚合物以I : I 20的分子比溶于pH值7. 8 8. 2磷酸盐缓冲液中，室温搅拌反应60 180分钟，两种分子中含有的基团发生特异性反应，生成阳离子树枝状大分子材料-亲水性聚合物，超滤法除去未反应的亲水性聚合物并更换为pH值6. 8 7. 2磷酸盐缓冲液；同时，RVG29多肽以I 10 I的分子比与阳离子树状大分子材料-亲水性聚合物上的特异基团室温搅拌反应12 36小时后生成阳离子树状大分子材料-亲水性聚合物-RVG29，分子排阻色谱法除去未反应的RVG29多肽，制得脑革El向载体。本专利技术中，所述的阳离子树枝状大分子材料选自树枝状聚赖氨酸(dendrigraftpoly-L-lysines DGLs,简称 DGLs)和聚酸胺-胺(polyamidoamine,简称 PAMAM)；所述的亲水性聚合物为聚乙二醇(polyethyleneglycol,简称PEG)。本专利技术中，将质粒DNA溶于50mM硫酸钠溶液中，所述脑载体溶液与DNA溶液以摩尔比3 10 I混合后，涡旋30s，制得脑靶向纳米基因递释系统。本法明的脑靶向纳米基因递释系统适用于将特定基因质粒经静脉给药形成，通过血脑屏障，递释入脑内。本专利技术采用氢核磁共振技术对脑靶向载体进行结构鉴定，结果显示，所述的树状大分子与含有双功能基团的PEG (琥珀酰亚胺-PEG3500-马来酰亚胺)反应后在3. 6ppm处出现PEG的特征吸收峰，表明树状大分子-PEG合成成功；树状大分子-PEG进一步与RVG29多肽反应后在2. 2ppm至3. 3ppm出现RVG29与PAMAM的质子峰，证明脑靶向载体三个成分均已连接成功。本专利技术通过琼脂糖凝胶电泳对脑靶向载体包载质粒DNA的能力进行验证，结果显示，在载体与质粒DNA的质量比在10 I时，未见明显DNA迁移，表明脑靶向载体可对质粒DNA进行完全包封，起到保护DNA的目的。本专利技术的脑靶向基因递释系统与未修饰脑靶向头基的系统包载荧光标记的质粒DNA后，分别孵育脑毛细血管内皮细胞，荧光显微镜观察结果显示，脑靶向组的摄取明显高于非靶向组，且所述的摄取依赖于RVG29多肽修饰。本专利技术的脑靶向基因递释系统孵育脑毛细血管内皮细胞后，对于内涵体进行染色，显示脑靶向基因递释系统主要通过内吞途径进入细胞。 本专利技术通过体外血脑屏障模型验证了放射标记的脑靶向基因递释系统的穿越脑毛细血管内皮细胞单层膜的效率显著过于非靶向组，而与此同时在实验整个过程中由脑毛细血管内皮细胞组成的单层血脑屏障模型保持完整。本专利技术利用活体成像仪考察脑靶向基因递释系统在裸鼠体内分布特性，经尾静脉给药后，结果显示脑靶向组在脑部的蓄积明显高于非靶向组，结果表明，RVG29多肽可高效的介导脑靶向基因递释系统的入脑。本专利技术所制备的载有报告基因绿荧光蛋白的脑靶向纳米基因递释系统经尾静脉给药后，表达48小时进行灌流和冰冻脑切片，荧光显微镜下观察绿荧光蛋白在脑内各区域的表达，结果显示，RVG29多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统可有效的介导报告基因在脑部各主要区域包括皮层、海马、纹状体和黑质的表达，表达量高于未修饰RVG29多肽的非靶向组。本专利技术所制备的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统，其特征在于，由脑靶向载体和编码特定基因的质粒DNA构成，所述的脑靶向载体由阳离子树状大分子材料、亲水性聚合物和狂犬病毒糖蛋白衍生肽RVG29组成。

【技术特征摘要】
1.一种多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统，其特征在于，由脑靶向载体和编码特定基因的质粒DNA构成，所述的脑靶向载体由阳离子树状大分子材料、亲水性聚合物和狂犬病毒糖蛋白衍生妝RVG29组成。2.按权利要求I所述的多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统，其特征在于，所述的脑革巴向载体为RVG29修饰的树枝状大分子脑祀向载体，其中，以阳尚子树枝状大分子材料、未水性聚合物和RVG29多肽为组分，三者以共价方式连接。3.按权利要求I所述的多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统，其特征在于，所述的脑靶向载体通过静电与编码特定基因的质粒DNA复合。4.按权利要求I或2所述的脑靶向纳米基因递释系统，其特征在于，所述的脑靶向载体通过下述步骤制备 阳离子树枝状大分子材料和亲水性聚合物以I : I 20的分子比溶于pH值7. 8 8.2磷酸盐缓冲液中，室温搅拌反应60 180分钟，生成阳离子树枝状大分子材料-亲水性聚合物，超滤法除去未反应的亲水性聚合物并更换为pH值6. 8 7. 2磷酸盐缓冲液；同时，RVG29多肽以I 10 : I的分子比与阳离子树状大分子材料-亲水性聚合物上的特异基团室温搅拌反应12 36小时后...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋晨，刘洋，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：