一种多功能靶向纳米胶囊抗癌药物的制备方法技术

本发明专利技术提出了一种新型多功能靶向纳米胶囊抗癌药物的分子设计与合成技术，利用羧基化的嵌段共聚物F127‑COOH和P123将紫杉醇包裹形成纳米胶束，并使用四甲氧基硅烷在胶束中形成一层二氧化硅壳稳定胶束结构以形成载药纳米胶囊；然后通过偶联剂将纳米胶囊表面的羧基与TRAIL蛋白表面的氨基偶联，形成表面偶联TRAIL蛋白的载药纳米胶囊。本发明专利技术的技术方法重复性好、条件温和，制备的多功能靶向纳米胶囊抗癌药物稳定，抗癌谱广且疗效显著。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是一种新型多功能靶向纳米胶囊抗癌药物的设计与合成技术，特别是一种包载紫杉醇的纳米胶囊表面偶联肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL蛋白的抗癌药物的设计与制备。
技术介绍
在全球范围内，恶性肿瘤的治疗是当今生命科学研究领域的一个难点。化疗是当前肿瘤治疗的主要手段之一，化疗常用的药物有紫杉醇（PTX）、阿霉素、柔红霉素、丝裂霉素等，但由于化疗药物的选择性不强，在杀灭癌细胞的同时也会不可避免地损伤人体正常的细胞，常常出现药物不良反应，存在毒性、非特异性和耐药性问题。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumornecrosisfactor-relatedapoptosisinducingligand,TRAIL)是一种人源性蛋白，作为一种新的抗肿瘤药物，可以在体内选择性地诱导肿瘤细胞系凋亡而不会对正常细胞有毒性，在肿瘤的治疗中有广泛的潜在应用前景。但是，单独使用TRAIL蛋白也存在不足之处，有些癌肿瘤对TRAIL蛋白不敏感。目前国内外的研究多集中在TRAIL蛋白与化疗药物的联合用药上，试图发挥TRAIL蛋白和化疗药物的双重功效以解决TRAIL蛋白敏感性问题并增强杀癌疗效。联合使用紫杉醇等化疗药物虽可提高非敏感性肿瘤细胞表面TRAIL蛋白受体，但仍缺乏靶向性和存在毒性问题。近年来TRAIL在动物体内的靶向性已经得到证实，综合利用TRAIL的抗肿瘤作用和靶向作用是新的研究方向。随着科技的发展，性能优良的高分子材料在医药行业发展迅速。载药纳米微粒是纳米技术与现代医药学结合的产物，是一种新型的药物输送载体。它能缓释药物、延长药物作用时间，透过生物屏障输送药物等，尤其在药物控释方面显示出其它输送体系无法比拟的优势。因此，我们试图将化疗药物包载进羧基化的嵌段共聚物F127-COOH和P123纳米微粒内，并在胶束中添加四甲氧基硅烷形成一层二氧化硅壳以稳定胶束结构，形成载药纳米胶囊；然后通过载药纳米胶囊表面的羧基（-COOH）与TRAIL蛋白的氨基（-NH2）偶联，形成一种在细胞和肿瘤水平均具有良好杀癌效果的新型多功能靶向纳米胶囊抗癌药物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提出一种新型多功能靶向纳米胶囊抗癌药物的分子设计与制备方法。首先通过嵌段共聚物F127羧基化修饰获得F127-COOH，然后将化疗药物包载进羧基化的嵌段共聚物F127-COOH和P123纳米微粒内，并添加四甲氧基硅烷形成一层二氧化硅壳以稳定胶束结构，形成载药纳米胶囊，最后通过载药胶囊表面的羧基（-COOH）与TRAIL蛋白的氨基（-NH2）偶联，制备出一种同时兼具靶向、抗癌、缓释等特点的新型多功能靶向纳米胶囊抗癌药物，其分子结构见图1。这种新型人工合成的纳米紫杉醇荷载胶囊-TRAIL蛋白药物（TRAIL-PTX-NCs））既具有靶向性、缓释化学药物又具有TRAIL蛋白和化学药物双重杀癌作用。同时，它有效地发挥了TRAIL蛋白和化学药物的杀癌特性，克服彼此存在的缺点。纳米紫杉醇荷载胶囊-TRAIL蛋白药物既可用于治疗TRAIL蛋白敏感的瘤细胞又可用于治疗TRAIL蛋白不敏感的癌细胞。一种新型多功能靶向纳米胶囊抗癌药物的设计与合成技术，其步骤为：1、嵌段共聚物F127的羧基化修饰将F127加入到无水甲苯中，搅拌至F127完全溶解，形成溶液A；向溶液A中加入与F127等重的丁二酸酐，搅拌后形成溶液B；将溶液B在150℃下沸浴加热5h，减压下蒸馏将甲苯蒸发，蒸馏后残液用二氯甲烷洗涤，然后加入乙醚沉淀产物，产物用乙醚重结晶，最后得到F127-COOH；所述F127与无水甲苯的质量体积比为1:1，质量体积比单位为mg:ml。2、载药纳米胶囊的制备称取P123和F127-COOH超声溶解于氯仿溶液，并加入紫杉醇或其它疏水性药物，100W超声分散15min，得到的混合溶液在75℃下真空干燥1h以上，待氯仿完全蒸发完后得到一层纳米薄膜，向薄膜内加入去离子水，200W超声分散12min即得到包载紫杉醇的载药纳米胶束；取四甲氧基硅烷超声分散于四氢呋喃溶液中，逐滴加入到载药纳米胶束中，并置于磁力搅拌仪上以750rpm转速搅拌3天，四甲氧基硅烷在胶束中水解形成一层二氧化硅壳，形成载药纳米胶囊；所述P123与F127-COOH的质量比为2:1-0.5,紫杉醇与P123、F127-COOH混合物的质量比为1:70-300；所述的四甲氧基硅烷与四氢呋喃的用量为：四甲氧基硅烷与四氢呋喃的体积比为7:100，四甲氧基硅烷与载药纳米胶束的体积比为1:100-1000。3、载药纳米胶囊与TRAIL蛋白的偶联在pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS）中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）以及载药纳米胶囊，室温避光旋转反应1h活化胶囊表面的羧基；将反应后的溶液装入截留分子量为8000g/mol的透析袋，置于PBS溶液中透析24h以除去未反应的EDC和NHS，再向透析后的溶液中加入TRAIL蛋白，4℃避光旋转反应8-16h，即得到偶联TRAIL蛋白的载药纳米胶囊，所述磷酸盐缓冲液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、载药纳米胶囊的用量比为3:5:6:1,单位为ml:mg:mg:ml；所述TRAIL蛋白用量与载药纳米胶囊用量比为1:10-40；单位为mg:ml。4、载药纳米胶囊的形态检测和稳定性测定取20μl载药纳米胶囊滴加在碳支持膜型铜网上，室温条件下晾干。然后使用TecanaiG220S-TWIN透射电子显微镜观察和拍照。使用MalvernZetasizerNano-S粒度分析仪测定载药纳米胶囊的粒径，并将胶囊稀释100倍、200倍、500倍、1000倍后测定胶囊粒径变化。5、纳米紫杉醇荷载胶囊载药量和缓释的测定取1mL制备的载药纳米胶囊，加入2mL乙腈超声溶胀后使用岛津分光光度计测定229nm处吸光值，并结合紫杉醇浓度-吸光度标准曲线计算紫杉醇含量以及胶囊载药量、包封率以及载药浓度。载药量=载药胶囊中实际负载的PTX含量/胶囊质量，包封率=载药胶囊中实际负载的PTX含量/反应加入的紫杉醇含量，载药浓度=载药胶囊中实际负载的PTX含量/胶囊溶液体积。取3mL制备的载药纳米胶囊装入截留分子量为8000g/mol的透析袋，置于30mL含0.1%Twain80的PBS（pH7.4）溶液中透析，在0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h分别取样200μL，使用戴安UltiMate3000PumPHPLC测定紫杉醇含量，并绘制缓释曲线。6、纳米紫杉醇荷载胶囊-TRAIL蛋白药物对癌细胞杀伤效果检测复苏肝癌细胞株HepG2于DMEM完全培养基（含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素），在37℃、5%CO2条件下培养至对数生长期。胰酶消化，离心收集对数生长期HepG2细胞重悬于DMEM培养基，以8×103细胞/孔的密度接种于96孔板，每孔含细胞培养液100μL，在37℃、5%CO2条件下培养8h使细胞贴壁，加入10μL不同浓度的偶联TRAIL载药纳米胶囊，共培养24h后加入10μLcck-8溶液，显色反应1-4h后使用Bio-RAD酶标仪测定吸光值并计算细胞存活率。7、纳米紫杉醇荷载胶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型多功能靶向纳米胶囊抗癌药物的的分子设计与制备技术，其特征在于：该制备技术包括如下步骤：（1）嵌段共聚物F127的羧基化修饰将F127加入到无水甲苯中，搅拌至F127完全溶解，形成溶液A；向溶液A中加入与F127等重的丁二酸酐，搅拌后形成溶液B；将溶液B在150℃下沸浴加热5h，减压下蒸馏将甲苯蒸发，蒸馏后残液用二氯甲烷洗涤，然后加入乙醚沉淀产物，产物用乙醚重结晶，最后得到F127‑COOH；所述F127与无水甲苯的质量体积比为1:1，质量体积比单位为mg:ml；（2）载药纳米胶囊的制备称取P123和F127‑COOH超声溶解于氯仿溶液，并加入紫杉醇或其它疏水性药物，100 W超声分散15 min，得到的混合溶液在75℃下真空干燥1 h以上，待氯仿完全蒸发完后得到一层纳米薄膜，向薄膜内加入去离子水，200 W超声分散12 min即得到包载紫杉醇的载药纳米胶束；取四甲氧基硅烷超声分散于四氢呋喃溶液中，逐滴加入到载药纳米胶束中，并置于磁力搅拌仪上以750 rpm转速搅拌3天，四甲氧基硅烷在胶束中水解形成一层二氧化硅壳，形成载药纳米胶囊；所述P123与F127‑COOH的质量比为2:1‑0.5, 紫杉醇与P123、F127‑COOH混合物的质量比为1:70‑300；所述的四甲氧基硅烷与四氢呋喃的用量为：四甲氧基硅烷与四氢呋喃的体积比为7:100，四甲氧基硅烷与载药纳米胶束的体积比为1:100‑1000；（3）载药纳米胶囊与TRAIL蛋白的偶联在磷酸盐缓冲液（PBS）中加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N‑羟基琥珀酰亚胺（NHS）以及载药纳米胶囊，室温避光旋转反应1 h活化胶囊表面的羧基；将反应后的溶液装入截留分子量为8000 g/mol的透析袋，置于PBS溶液中透析24 h以除去未反应的EDC和NHS，再向透析后的溶液中加入TRAIL蛋白，4℃避光旋转反应8‑16 h，即得到偶联TRAIL蛋白的载药纳米胶囊；所述磷酸盐缓冲液、1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐、N‑羟基琥珀酰亚胺、载药纳米胶囊的用量比为3:5:6:1,单位为ml:mg:mg:ml；所述TRAIL蛋白用量与载药纳米胶囊用量比为1:10‑40；单位为mg:ml。...

【技术特征摘要】
1.一种新型多功能靶向纳米胶囊抗癌药物的的分子设计与制备技术，其特征在于：该制备技术包括如下步骤：（1）嵌段共聚物F127的羧基化修饰将F127加入到无水甲苯中，搅拌至F127完全溶解，形成溶液A；向溶液A中加入与F127等重的丁二酸酐，搅拌后形成溶液B；将溶液B在150℃下沸浴加热5h，减压下蒸馏将甲苯蒸发，蒸馏后残液用二氯甲烷洗涤，然后加入乙醚沉淀产物，产物用乙醚重结晶，最后得到F127-COOH；所述F127与无水甲苯的质量体积比为1:1，质量体积比单位为mg:ml；（2）载药纳米胶囊的制备称取P123和F127-COOH超声溶解于氯仿溶液，并加入紫杉醇或其它疏水性药物，100W超声分散15min，得到的混合溶液在75℃下真空干燥1h以上，待氯仿完全蒸发完后得到一层纳米薄膜，向薄膜内加入去离子水，200W超声分散12min即得到包载紫杉醇的载药纳米胶束；取四甲氧基硅烷超声分散于四氢呋喃溶液中，逐滴加入到载药纳米胶束中，并置于磁力搅拌仪上以750rpm转速搅拌3天，四甲氧基硅烷在胶束中水解形成一层二氧化硅壳，形成载药纳米胶囊；所述P123与F127-COOH的质量比为2:1-0.5,紫杉醇...

【专利技术属性】
技术研发人员：王行国，刘欣，顾豪爽，李岳彬，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42