本发明专利技术涉及一种利用减毒伤寒沙门菌递送的HBV突变型preC/C基因疫苗和HBV-热休克蛋白70融合基因疫苗及制备方法和应用。其分别包括突变型HBVpreC/C基因与HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因或HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因，目的基因的真核细胞表达载体均为VR1012。首先将目的基因使用真核表达载体，构建质粒，然后采用电转化的方法，转化减毒伤寒沙门菌SL7207，得到携带目的基因的重组减毒伤寒沙门菌。该重组减毒伤寒沙门菌能有效诱导特异性体液免疫和细胞免疫，可用于乙型肝炎的预防和治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用减毒伤寒沙门菌递送的HBV突变型preC/C基因疫苗和一种HBV-热休克蛋白70融合基因疫苗及其制备方法和应用，具体为利用减毒伤寒沙门菌递送的一种HBV突变型preC/C基因疫苗、一种HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因疫苗和一种HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因疫苗及其制备方法和应用，属于乙肝疫苗的设计制造及免疫效果检测的生物学领域。
技术介绍
慢性乙型肝炎严重危害人类健康，目前尚无特效治疗手段。乙肝病毒(HBV)感染人体后发生慢性化的主要原因是被感染者缺乏有效的特异性细胞免疫应答，不能清除体内病毒。由于DNA疫苗在诱导机体特异性细胞免疫方面具有独特优势，已作为针对慢性乙肝 具有潜力的免疫治疗手段被广泛研究。目前乙肝DNA疫苗研究的焦点在于(I)如何诱导足够强的特异性细胞免疫，以达到抑制或消灭病毒、治疗乙肝的目的；(2)改良接种方式，易于为患者接受。使用分枝杆菌热休克蛋白70羧基端(HSP70c)或T细胞刺激表位(HSP70t)基因构建融合基因疫苗可以起到佐剂的作用，同时减少机体针对HSP70的免疫应答。利用携带DNA质粒的减毒伤寒沙门菌口服，可直接将DNA质粒递送至抗原呈提细胞，极大提高DNA疫苗的利用率，同时口服的免疫方式安全方便，易于为患者接受。本专利技术针对热休克蛋白融合基因疫苗和利用减毒伤寒沙门菌递送DNA疫苗的诸多特性和优点，采用现代分子生物学技术和手段对其进行了进一步的研究和改进。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种以HBV突变型preC/C基因为目的基因构建的重组HBV DNA疫苗(VC)、一种HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因为目的基因构建的重组HBV DNA疫苗(VCC)和一种以HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因为目的基因构建的重组HBV DNA疫苗(VCT)。本专利技术的第二个目的在于提供一种携带HBV突变型preC/C基因的重组减毒伤寒沙门菌(SVC)、一种携带HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因的重组减毒伤寒沙门菌(SVCC)和一种携带HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因的重组减毒伤寒沙门菌(SVCT)。首先将目的基因使用真核表达载体，构建质粒，然后采用电转化的方法，转化减毒伤寒沙门菌SL7207，得到携带目的基因的重组减毒伤寒沙门菌。本专利技术的第三个目的在于提供一种携带HBV突变型preC/C基因的重组减毒伤寒沙门菌、一种携带HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因的重组减毒伤寒沙门菌和一种携带HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因的重组减毒伤寒沙门菌用于乙型肝炎的预防和治疗。该重组减毒伤寒沙门菌能有效诱导特异性体液免疫和细胞免疫，可用于乙型肝炎的预防和治疗。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的一种HBV突变型preC/C基因疫苗(VC)，其包括HBV突变型preC/C基因(简称preC/C)，该目的基因的真核细胞表达载体为VR1012。所述的HBV突变型preC/C基因是HBVpreC/C基因经人工引入4个点突变，其核苷酸序列如序列表中的序列I所示。一种构建HBV突变型preC/C基因疫苗(VC)的方法，其步骤如下首先以含有HBV突变型preC/C基因的质粒VEC4为模板，用PCR扩增出HBV突变型preC/C基因序列，无终止密码子，连入T-Easy载体，再通过双酶切及再连接将目的基因连入真核表达载体VR1012，克隆筛选得到HBV突变型preC/C基因疫苗无终止密码子质粒，其核苷酸序列如序列表中的序列I所示。 一种HBV突变型preC/C-热休克蛋白70融合基因疫苗，其包括HBV突变型preC/C-热休克蛋白70融合基因，该目的基因的真核细胞表达载体为VR1012。所述的HBV突变型preC/C-热休克蛋白70融合基因是HBV突变型preC/C_热休克蛋白70羧基端融合基因(简称preC/C-HSP70c)。即一种HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因疫苗(VCC)，其包括HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，该目的基因的真核细胞表达载体为VR1012。真核细胞表达载体VR1012上插入核苷酸序列的HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因。一种构建HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因疫苗(VCC)的方法，其步骤如下首先以含有HBV突变型preC/C基因的质粒VEC4为模板，用PCR扩增出HBV突变型preC/C基因序列，无终止密码子，连入T-Easy载体，再通过双酶切及再连接将目的基因连入真核表达载体VR1012，克隆筛选得到HBV突变型preC/C基因疫苗无终止密码子质粒，其核苷酸序列如序列表中的序列I所示；再以含有分枝杆菌热休克蛋白70基因的质粒PT-HSP70为模板，PCR扩增热休克蛋白70羧基端基因，连入T-Easy载体，再通过双酶切及再连接将目的基因连入HBV突变型preC/C基因疫苗无终止密码子质粒，克隆筛选得到HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因疫苗质粒。所述的HBV突变型preC/C-热休克蛋白70融合基因是HBV突变型preC/C_热休克蛋白70T细胞表位融合基因(简称preC/C-HSP70t)。即一种HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因疫苗(VCT)，其包括HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因，其核苷酸序列如序列表中序列3所示，该目的基因的真核细胞表达载体为VR1012。真核细胞表达载体VR1012上插入核苷酸序列的HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因。一种构建HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因疫苗(VCT)的方法，其步骤如下首先以含有HBV突变型preC/C基因的质粒VEC4为模板，用PCR扩增出HBV突变型preC/C基因序列，无终止密码子，连入T-Easy载体，再通过双酶切及再连接将目的基因连入真核表达载体VR1012，克隆筛选得到HBV突变型preC/C基因疫苗无终止密码子质粒，其核苷酸序列如序列表中的序列I所示；再以含有分枝杆菌热休克蛋白70基因的质粒pT-HSP70为模板，PCR扩增热休克蛋白70T细胞表位基因，连入T-Easy载体，再通过双酶切及再连接将目的基因连入HBV突变型preC/C基因疫苗无终止密码子质粒，克隆筛选得到HBV突变型preC/C-热休克蛋白70T细胞表位融合基因疫苗质粒。一种携带HBV突变型preC/C基因的重组减毒伤寒沙门菌(SVC)，其稳定携带如上所述的HBV突变型preC/C基因疫苗VC。一种携带HBV突变型preC/C基因的重组减毒伤寒沙门菌SVC的构建方法，其步骤如下使用电转化仪，将HBV突变型preC/C基因疫苗VC转化至减毒伤寒沙门菌SL7207，克隆筛选得到稳定携带VC的重组减毒伤寒沙门菌SVC。一种携带HBV突变型preC/C-热休克蛋白70羧基端融合基因的重组减毒伤寒沙门菌(SVCC)，其稳定携带如上本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种HBV突变型preC/C基因疫苗，其包括HBV突变型preC/C基因，该目的基因的真核细胞表达载体为VR1012。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：貌盼勇，刘泽，辛绍杰，胡燕，白冰珂，沈宏辉，高蓉，侯俊，王志杰，罗声栋，柴艳涛，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三〇二医院，北京绿竹生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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