鼠伤寒沙门菌X3306lux及其在活体成像中的应用制造技术

鼠伤寒沙门菌X3306lux及其在活体成像中的应用，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2012年3月13日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.5895。鼠伤寒沙门菌X3306是携带毒力质粒pStSR100的强毒株，可作为标准毒株，应用于鼠伤寒沙门菌致病机制的研究。X3306lux是在X3306基础上构建的具有稳定生物发光性能的菌株。经位点特异性重组，将管家基因E.colifrr启动子和Lux操纵子插入X3306染色体中稳定表达（同时插入位点不破坏基因组基因功能，对细菌无不利影响）。Lux操纵子在其上游连接的管家基因E.colifrr启动子的调控下，组成性表达荧光素酶和底物，无需外加筛选压力和底物维持细菌发光。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物
，特别涉及鼠伤寒沙门菌X33061UX及其在活体成像中的应用。
技术介绍
鼠伤寒沙门菌{Salmonella是一种重要的人畜共患病原菌，主要经水和食物传播，可引起食物中毒、胃肠炎等肠道传染病，其感染发病率居沙门菌感染的首位。X3306是携带毒力质粒pStSRIOO的鼠伤寒沙门菌强毒株，可作为标准毒株，应用于鼠伤寒沙门菌致病机制的研究。近年来，活体动物体内光学成像技术以其操作简便及直观性在生命科学研究中得以不断发展。这种成像技术可以直接实时观察标记的基因及细胞在活体动物体内的活动及反应。利用光学标记的细菌建立动物模型可以实时动态追踪病原菌在动物活体内的感染过程，深入研究病原菌致病机制，进行药物研究及筛选等。主要采用荧光(fluorescence)与生物发光(bioluminescence)两种技术。荧光发光是通过激发光激发荧光基团到达高能量状态后产生发射光。荧光技术操作简便，信号较强，但应用于体内试验时在受到激发光激发时生物体很多物质都会产生荧光，如皮肤、毛发和各种组织及食物等。特别是当被标记的靶点深藏于组织内部需要较高能量的激发光时也产生很强的非特异性荧光，且病原菌在动物体内有复杂的定位，荧光的激发光需要穿过组织到达靶点，发射光需要从体内出来，路径较长。信号水平取决于激发光的强度、发光细胞的数量、靶点的深度、光线穿过的组织对其的吸收及散射等因素，使得荧光强度很难定量。 生物发光是用荧光素酶(Iuciferase)基因标记。以荧光素酶作为体内报告源的生物发光是以酶和底物的特异作用而发光，特异性极强，因动物本身没有任何自发光，使得生物发光具有极低的背景，极高的信噪比。生物发光成像相对于荧光成像，其最大的特点就是体内检测的高灵敏度。因此，生物发光技术成为目前研究的热点。细菌操纵子由荧光素酶基因和其底物合成酶基因组成，带有这种操纵子的细菌会持续发光不需要外源性底物。近年来研究者们陆续将其克隆至多种载体导入病原菌中，应用生物发光技术和小动物成像系统监测病原菌感染过程。但以质粒为基础的生物发光技术在无抗生素选择下不稳定，不能用于体内的长期研究。对实验小鼠注射抗生素来筛选携带完整发光质粒的沙门菌，会造成小鼠的耐药性，且会在某种程度上干扰实验结果。又因质粒的拷贝数不同，单细胞发光强度不稳定，无法以发光强度来定量检测病原菌。2010年，Kevin Howe构建质粒pBEN276,利用该质粒可将Zm操纵子克隆至细菌染色体(图I),其生物发光信号可以用于精确定量，本专利技术由此在鼠伤寒沙门菌X3306基础上构建了具有稳定生物发光性能的菌株X33061ux。
技术实现思路
解决的技术问题 本专利技术针对荧光标记的体内检测特异性低，背景高，难定量等缺陷，及以往以基于质粒的生物发光检测需外加筛选压力和底物，且难以定量等不足，提供了一种可以稳定发光的鼠伤寒沙门菌X33061ux及其在活体成像中的应用。技术方案 鼠伤寒沙门菌{Salmonella typhimuri um) X3306 lux,该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2012年3月13日，保藏单位名称中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 5895。鼠伤寒沙门菌typhimuri um) X3306 Iux在活体成像中的应用。鼠伤寒沙门菌(5^7^9/7(9773 皿η·" ) X3306下文简称X3306 ;鼠伤寒沙门菌{Salmonella typhimurium) X33O6Iux 下文简称 X33O6Iux0有益效果该鼠伤寒沙门菌具有稳定的生物发光性能，弥补了生物荧光的细菌检测需激发光源且在体内特异性低，背景高，难定量等缺陷。经位点特异性重组，将管家基因E. coli /rr启动子和操纵子插入宿主菌染色体中稳定表达(同时插入位点不破坏基因组基因功能，对细菌无不利影响)。操纵子在其上游连接的管家基因E.co7i /rr启动子的调控下，组成性表达荧光素酶和底物，无需外加筛选压力和底物维持细菌发光。并通过实验检测到细菌的数量与其发光强度成正比，且在小鼠活体内能持续检测到细菌的生物发光。弥补了以往质粒标记的生物发光细菌需外加筛选压力和底物，影响发光检测，且单位细胞发光量不稳定等不足之处。荧光酶基因插入染色体中稳定表达，单位细胞的发光数量很稳定。加上生物发光技术极高的特异性和信噪比，即便标记细胞在动物体内有复杂的定位，亦可从动物体表的信号水平直接得出发光细胞的相对数量。可广泛应用于体外细胞感染模型和体内实验动物模型的建立。结合利用活体成像仪器可实时动态的持续监测鼠伤寒沙门菌在小鼠活体内的入侵、增殖及扩散情况。为鼠伤寒沙门菌及伤寒沙门菌致病机制的深入研究，药物研究和筛选及相关疾病防治策略的研究等提供便利的工具。附图说明图I为pBEN276质粒图谱，tnsABCD为编码Tn7转座子的基因。操纵子luxCDABE编码荧光素酶和底物，引入多克隆酶切位点Xhol和Notl，将其连接于Tn7转座子侧翼。Lux操纵子3’端连接Ε. coli管家基因frr的启动子，启动Zm操纵子的组成性表达。图2为菌落生物发光检测结果(I和2依次为X33061ux单菌落在whitelight和luminescence条件下成像，3和4依次为X 3306单菌落在whitelight和luminescence条件下成像)。图3为菌液生物发光检测结果(1、2 :white light模式成像X33061ux ;3: whitelight 模式成像 X3306 ;4、5: luminescence 模式成像 X33061ux; 6: luminescence 模式成像 X 3306)。图4为X33061ux发光性能稳定性检测结果(光强与在无选择压力条件下传代天数的关系) 图5为稳定发光菌在活体内信号检测结果(1，2，3依次为将感染X33061UX的小鼠于white light模式成像，luminescence模式成像和merge图像)。图6为光子数与细菌数关系的发光检测图(I飞倍比稀释X33061ux菌液；6 X 3306阴性对照)。图7为光子数与细菌数关系图(I 5 :10倍稀释X33061ux菌液；6 :X3306阴性对照)。 具体实施例方式实施例I 菌株具体构建及鉴定 I、材料准备 I. I质粒与菌株 质粒PBEN276由法国自然资源研究所动物传染病和公共健康病原菌研究实验室Pierre Germon 教授惠赠。Kevin Howe, Attila Karsi, Pierre Germon, et. al.Development of stable reporter system cloning luxCDABE genes into chromosome ofSalmonella enterica serotypes using Tn7 transposon . BMC Microbiology 2010,10:197 鼠伤寒沙门菌typhimurium') X3306由美国亚利桑那州立大学生物科学学院 ROY CURTISS III 教授惠赠。HIDEN0RI MATSUI, CHRISTOPHER 本文档来自技高网...

【技术保护点】
鼠伤寒沙门菌(Salmonella？typhimurium)？X3306lux，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2012年3月13日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC？No.5895。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄瑞，李嫄渊，储元元，叶颖，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：