本发明专利技术公开了一种用于沙门菌和大肠杆菌O78的多重PCR快速检测的试剂盒。包括：PCR反应mix(含buffer，dNTP，引物等)，酶混合物以及阳性质控。本发明专利技术试剂盒能够检测畜禽肛拭子、粪便以及食品中的沙门菌和大肠杆菌O78，具有操作简单、特异性好、灵敏度高(可达10
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及沙门菌和大肠杆菌078多重PCR快速检测方 法与应用。
技术介绍
快速检测与鉴定致病性病原菌是及时有效的预防和控制病原菌传播的前提，对于 畜禽业的健康正常发展以及食品的检验检疫安全和人类健康具有重要意义。 目前食品卫生微生物学检验（GB/T4789. 1-2003)病原菌仍主要依靠传统的细 菌培养、血清学、生化鉴定等方法，检测周期长（需4~7d)，操作繁琐复杂，特异性、敏感度 均较低，不能适应快速检测的需要。1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的荧光 PCR方法因其污染小，灵敏度高等优势很快发展成为分子生物学检测的重要手段，但由于荧 光PCR的反应体系更为复杂，引物和探针之间的干扰难以预测，且荧光探针价格昂贵，故多 重荧光PCR方法的建立较为困难，其实用性也大受影响。普通多重PCR技术的优势在于可 以同时对成组病原物进行检测，且操作和普通PCR-样简单，所以可以大大提高检测效率、 缩短检测周期、降低检测成本，具有显著地经济效益和社会效益，特别适合成组病原体的检 测，不论在致病微生物引起的传染病诊断方面，还是在食品、化妆品以及环境中微生物的检 验方面都具有极高的应用价值。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供用于沙门菌和大肠杆菌078多重PCR快速检测的 引物。 本专利技术要解决的另外一个技术问题是提供一种沙门菌和大肠杆菌078多重PCR快 速检测方法。 对于用于沙门菌和大肠杆菌078多重PCR快速检测的引物，本专利技术采用的技术方 案是，包括： (1)具有SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5 所 示的核苷酸序列；或 (2)与（1)的核苷酸序列具有基本序列同源性，并具有相同功能的核苷酸序列。 对于沙门菌和大肠杆菌078多重PCR快速检测方法，本专利技术采用的技术方案是包 括以下步骤： (1)设计和合成引物；所述引物包括扩增细菌16srDNA部分序列的通用引物 926F、扩增沙门菌的特异性引物invA-F308和invA-R1128以及扩增大肠杆菌078的特异引 物 078-F1 和 078-R1 ; ⑵样品DNA申旲板制备；包括：a)取沙门菌或大肠杆菌078的菌液lmL于12000r/min离心5min;沉淀加入 100yL无菌水，混勾后，于100°C沸水浴10-15min，立即冰浴5min，12000r/min离心5min， 上清液即为DNA模板；或b)取lg新鲜鸡粪加入5mLLB液体培养基，37°C，200rpm，增菌5h;低速离心5min; 取lmL上清，12000rpm离心5min，弃上清，加入100yLddH20悬浮沉淀，置100°C水浴煮沸 10~15min。12000rpm离心3min，上清即为DNA模板；或 c)取奶粉5g加入100mLLB液体培养基中，高压灭菌后取lmL添加10倍梯度倍比 稀释的沙门菌和大肠杆菌078菌液各100uL，37°C250rpm增菌5h;12000rpm离心5min，弃 上清，加入100ULddH20悬浮沉淀，置100°C水浴煮沸10~15min。12000rpm离心3min， 上清即为DNA模板；或d)取107cfu/mL的沙门菌和大肠杆菌078用灭菌化妆水10倍比梯度稀释，分别取 不同浓度的化妆水稀释菌液l〇〇uL加入900uLLB液体培养基中，37°C250rpm增菌5h;SDS 法裂解制备DNA模板； (3)多重PCR扩增反应；所述多重PCR扩增反应是以步骤⑵提取的DNA作为模 板，采用多重PCR法进行扩增，扩增体系和反应条件如下： 2XPCRbuffer2.5yL，0.2mMdNTPs，invA-F308 和invA-R1128 各 0.04yM， 078-F1 和 078-R1 各 0? 36yM，926F和 1492R各 0? 08yM，exTaq1. 25U，DNA模板 1. 0yL， ddH20 补足 25yL;PCR扩增条件为：94°C，4min;94°C30s，60°C30s，72°C45s，共 28 循环；最 后72°C后延伸5min; (4)将PCR扩增反应产物进行脂糖电泳检测；将5yL所述扩增反应产物用1 %琼 脂糖电泳分离，根据条带有无和大小判定结果。 作为优选，所用病原菌分别购自中国工业微生物所、中国兽医菌种保藏中心和广 州微生物所菌种保藏中心：鸡肠炎沙门菌（Salmonellaenterica) :CICC21510,鼠伤寒沙 门氏菌（S.typhimurium) :CMCC50115,猪霍乱沙门氏菌（S.choleraesuis) :ATCC13312;大 肠杆菌 078(Escherichiacoli078) :CVCC1490、ATCC35401。 本专利技术主要基于靶标基因的PCR技术和多重PCR扩增技术对大肠杆菌078和沙门 菌进行快速检测，同时对环境中广泛存在的细菌进行扩增，避免假阴性结果的产生，达到一 次性快速检测沙门菌和大肠杆菌078的目的。 本专利技术所选用的各病原菌的基因均具有较强的特异性和灵敏性。通用阳性质控 引物的设计选用细菌16srDNA-段高度保守序列，存在于所有细菌中且片段大小相近，约 566bp。沙门菌的invA基因和0780-抗原特异基因为沙门菌和大肠杆菌078特有的毒力因 子基因，且序列高度保守。 本专利技术的有益效果是：畜禽养殖方面，目前都是规模化养殖，密度大，病原菌感染后传播快，而传统的病 原菌检测方法操作繁琐，耗时耗力，不能起到有效地监测和预防作用，也很难指导发病后的 合理用药。而国标中对于食品和化妆品等领域微生物的检测仍主要依靠传统的细菌培养、 血清学、生化鉴定等方法，检测周期长（需4~7d)，操作繁琐复杂，特异性、敏感度均较低， 不能适应快速检测的需要。本专利技术提供的多重PCR检测方法可以弥补以上不足，提供一种 沙门菌和大肠杆菌078快速高效的分子检测方法。多重PCR扩增结果表明：沙门菌和大肠 杆菌078的特异引物具有较高的检测灵敏度和特异性，细菌通用引物可以高灵敏度的广谱 扩增细菌16srDNA的部分序列，很好的起到了阳性质控条带的作用，有效地避免了样品中 假阴性结果的产生。本专利技术提供的畜禽粪便增菌培养后制备DNA的方法，可以有效缩短检 测的时间，提高检测效率。同时，增菌培养后可使扩增体系中死菌的模板DNA所占比例大大 降低，从而确保了对病原菌的传播和防治情况进行实时检测的可靠性。总之，本专利技术提供的 一种沙门菌和大肠杆菌078多重PCR检测方法操作简单、高效、灵敏，为病原菌的实时监测 和快速诊断提供了有效手段，可以推广应用于畜禽养殖、食品卫生、环境安全等领域病原菌 的快速检测。 本专利技术解决了病原菌传统技术检测周期长（需4~7d)，操作繁琐复杂，特异性、敏 感度均较低的问题。【附图说明】 下面结合附图和【具体实施方式】对本专利技术作进一步详细的说明。 图1是本专利技术实施例的单对引物特异性验证。图2是本专利技术实施例的多重PCR特异性扩增产物电泳分析。 图3是本专利技术实施例的多重PCR检测灵敏度实验结果。 图4是本专利技术实施例的模拟鸡粪样品多重PCR检测灵敏度实验结果。图5本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于沙门菌和大肠杆菌O78多重PCR快速检测的引物，其特征在于，包括：(1)具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；或(2)与(1)的核苷酸序列具有基本序列同源性，并具有相同功能的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡茂秀，王莎莎，俞超，
申请(专利权)人：青岛康伦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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