本发明专利技术公开了一种CYP2C19*2基因型快速检测试剂盒，包括PCR反应混合液，PCR反应混合液原料包括DNA聚合酶、DNTPs、CYP2C19*2上游引物、CYP2C19*2下游引物、CYP2C19*2突变型分子信标、CYP2C19*2野生型分子信标、MgCl2、5x Colorless Reaction Buffer和细胞裂解液。本发明专利技术克服了针对现有的临床检测CYP2C19*2 基因型的试剂盒及其检测方法难以满足指导临床用药的快速诊断，提供一种能快速检测CYP2C19*2基因型，减小患者疾病治疗风险的CYP2C19*2基因型快速检测试剂盒及其检测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种CYP2C19*2基因型快速检测试剂盒及 其检测方法。
技术介绍
单核苷酸多态性（SingleNucleotidePolymorphism,SNP)主要是指在基因组水 平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。在基因组DNA中，任何碱基均有可能 发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总体来 说，位于编码区内的SNP(codingSNP，cSNP)比较少，但它在遗传性疾病研究中却具有重要 意义，因此cSNP的研究更受关注。 从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP可分为2种：一种是同义cSNP，S卩SNP所 致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的 含义相同；另一种是非同义cSNP，指碱基序列的改变可使以其为模板翻译的蛋白质序列发 生改变，从而影响蛋白质的功能，这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。SNP与许多疾病相关，决定了人类疾病的易感性和药物反应的差异性。因此，SNP 在分析诊断、临床检验、法医学、病原检测、遗传疾病和新药研发等方面具有重要的应用价 值。 分子信标（molecularbeacon)是一种在5'和3'末端自身形成一个8个碱基左 右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的 荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。在这种结构下，荧光基团被激发后产生的 光子被淬灭剂淬灭，所以不会产生荧光。在高温变性或之后的退火杂交过程中，这种结构被 破坏，导致荧光基团远离淬灭基团，荧光便能被激发并被监测仪器探测到。CYP2C19是CYP450酶第二亚家族中的重要成员，在肝脏中大量表达，参与多种药 物的代谢。由于CYP2C19基因具有单核苷酸多态性，因此CYP2C19酶活性存在显著的个体差 异和种族差异。其最常见的两种突变是CYP2C19*2和CYP2C19*3,它们都属与非同义突变， 所以能直接影响该酶对药物的代谢能力。CYP2C19*2 (681G>A，rs244285)变异，导致翻译过 程中产生一个异常的剪接位点从而产生一个截短的无功能的蛋白质。在药物代谢过程中， 该突变会使一些药物的血药浓度升高，如抗凝血药物氯吡格雷、抗抗癫痫药物苯妥英钠等， 使患者出现不良的药物反应。CYP2C19*2突变基因型有纯合子A/A和杂合子G/A两种，其野生型基因型为G/G。 纯合子A/A患者对药物的代谢类型属于慢代谢型，杂合子G/A患者对药物的代谢类型属于 中等代谢型，而野生型G/G患者对药物的代谢属于正常代谢型。通过确定患者的基因型，就 可以判定患者的药物代谢类型，从而帮助医生正确选择合适的药物并合理调整药物剂量， 提高药物使用有效性，降低毒副作用。 目前，用于临床检测CYP2C19*2基因型的试剂盒大多使用探针法，测定DNA来确定 CYP2C19*2的代谢类型，从而为诊断疾病做出依据，而现有的探针法均需要使用提取纯化的 DNA作为模板。而提取纯化的DNA，增加了抽取血液和提取血液DNA的步骤。从抽血到提取 纯化DNA至少需要4个小时。并且目前市面上的试剂在使用时操作者需要根据试剂盒中的 试剂组分和说明配制试剂然后才能使用，此过程容易造成试剂的污染，并增加了检测操作 步骤，延长了检测时间，从抽血提取DNA到得出检测结果的整个过程至少需要8小时。因此， 难以满足临床疾病的快速诊断，增加了患者疾病治疗的风险。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种能快速检测CYP2C19*2基因型，减小患者疾 病治疗风险的CYP2C19*2基因型快速检测试剂盒及其检测方法。 为了解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：CYP2C19*2基因型快速检测 试剂盒，包括PCR反应混合液，PCR反应混合液原料包括DNA聚合酶、dNTPs、CYP2C19*2上 游引物、CYP2C19*2下游引物、CYP2C19*2突变型分子信标、CYP2C19*2野生型分子信标、 MgC12、PCR缓冲液和细胞裂解液。 采用本专利技术技术方案的CYP2C19*2基因型快速检测试剂盒，PCR缓冲液的作用是 有助于酶的稳定，给聚合酶提供一个最适合酶催化反应条件； dNTP是deoxy-ribonucleosidetriphosphate(脱氧核糖核苷三憐酸）的缩写， dNTPs则是由四种脱氧核苷酸（dATP、dGTP、dTTP、dCTP)以相同的比例混合而成，是DNA复 制的原料；MgCl2的作用是提供Mg2+与dNTP以及DNA模板结合形成复合体，只有这种复合体 才能被DNA聚合酶识别；DNA聚合酶为GoTaqDNAPolymerase,以DNA为复制模板，从DNA由5'端点开始 复制到3'端的酶。CYP2C19*2上游引物、CYP2C19*2下游引物作为DNA复制的起始点，因为在DNA合 成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上，因此，在核酸合成反应时，弓丨 物作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用。 细胞裂解液的作用是溶解细胞质和细胞膜，破坏分子间许多微弱的化学键，分解 一些蛋白酶，降低细胞裂解之后产生的杂质对PCR反应的影响。因此，由于上述PCR反应 混合液中含有细胞裂解液，所以加入口腔细胞作为模板就可实现对CYP2C19*2基因型的检 测。上游引物和下游引物是在CYP2C19*2基因检测位点两端设计的特异性引物，突变型分 子信标特意地与CYP2C19*2突变序列结合，而野生型分子信标与正常的CYP2C19*2基因特 异结合。 本专利技术的检测原理为：在CYP2C19*2基因突变位点两侧保守区域设计一对引物， 并在突变位点序列处设计两个分子信标，CYP2C19*2突变型分子信标、CYP2C19*2野生型分 子信标，CYP2C19*2野生型分子信标与未突变序列结合，CYP2C19*2突变型分子信标与突 变位点序列结合。野生型分子信标5'端用6-FAM荧光素标记，而突变型分子信标5'端用 AlexaFluor594或CalFluorRed610突光素标记，或者野生型分子信标5'端用Alexa Fluor594或CalFluorRed610荧光素标记，而突变型分子信标5'端用6-FAM荧光素标 记，6-FAM标记的分子信标的3'端用BHQ1淬灭基团标记，而AlexaFluor594或CalFluor Red610标记的分子信标3'端都用BHQ2淬灭基团标记。在PCR退火阶段，野生型分子信 标与未突变的序列结合，而突变型分子信标与有突变位点的序列结合，在结合后，荧光基团 远离淬灭基团，此时发出的荧光被实时荧光定量检测仪记录下来，从而通过荧光的颜色来 判断所检测基因的基因型；试剂盒中的PCR反应混合物中包括有细胞裂解液，通常，PCR反 应都是以细胞中提取纯化的DNA作为模板，如果直接加入细胞提供模板，则在PCR过程中细 胞裂解不彻底，并且细胞裂解之后的细胞碎片以及一些蛋白酶会对PCR反应造成阻碍，容 易造成实验失败。而专利技术人在通过多次试验，把细胞裂解液的成分以一定的比例混合加在 PCR反应混合液中，实现了直接以口腔细胞为模板进行PCR反应，从而可在PCR本文档来自技高网...
【技术保护点】
CYP2C19*2基因型快速检测试剂盒，其特征在于：包括PCR反应混合液，PCR反应混合液原料包括DNA聚合酶、dNTPs、CYP2C19*2上游引物、CYP2C19*2下游引物、CYP2C19*2突变型分子信标、CYP2C19*2野生型分子信标、MgCl2、PCR缓冲液和细胞裂解液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：任晓东，罗志超，
申请(专利权)人：重庆京因生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：重庆;85
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