用于建立人工多能干细胞的高效方法技术

本发明专利技术提供了iPS细胞的产生方法以及用于改进iPS细胞建立效率的方法，其每一种涉及将 (1) 携带核重编程因子的附加型载体和 (2) 不同于附加型载体(1)且携带EBNA-1的附加型载体引入体细胞的步骤。还提供：iPS细胞建立效率改进试剂，其包含携带编码EBNA-1的核酸的附加型载体；以及用于产生iPS细胞的试剂盒，其包含携带编码核重编程因子的核酸的附加型载体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及有效建立诱导多能干（以下被称为iPS)细胞的方法和用于其的试剂 等。更具体地，本专利技术涉及iPS细胞的产生方法，其包括将以下引入体细胞的步骤，（1)含 有编码核重编程因子的核酸的附加型载体；和（2)不同于（1)的含有编码EBNA-I的核酸 的附加型载体，和进一步，当期望时，含有编码P53功能的抑制剂的核酸的附加型载体。本 专利技术还涉及用于改进iPS细胞建立效率的试剂，其包含含有编码EBNA-I的核酸的附加型载 体，等。
技术介绍
近年来，小鼠和人iPS细胞已相继地建立。Yamanaka等人通过将0ct3/4、Sox2、 Klf4和c-Myc基因转入来自小鼠和人的成纤维细胞内而诱导iPS细胞（专利文献1和非专 利文献1和2)。另一方面，Thomson等人组使用Nanog和Lin28替代Klf4和c-Myc产生人 iPS细胞（专利文献2和非专利文献3)。 已经进行了各种尝试来增强iPS细胞建立效率。其中之一是优化重编程因子的组 合。本专利技术人报道，iPS细胞建立的效率可以通过使用0ct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc和Lin28 的5种因子的组合作为重编程因子并通过RNAi技术敲低p53的表达而显著地改进（专利 文献3和非专利文献4)。一些人认为，期望的是，避免抑制癌抑制基因 p53,即使是瞬时的， 特别是考虑将人iPS细胞应用于再生医学时，因为应当尽可能降低肿瘤化风险。另一方面， Maekawa等人报道，与使用OSK的3种因子相比，iPS细胞建立的效率可以通过将Glisl与 0ct3/4、Sox2和Klf4 (OSK) -起引入体细胞而更显著地改进（专利文献4和非专利文献 5)。此外，Maekawa 等人报道，通过使用 0ct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc、Lin28 和 Gl i s I (OSKULG) 的6种因子建立人iPS细胞的效率是p53 shRNA与0ct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc和Lin28 (OSKUL)的5种因子的组合的效率的约2倍（美国临时专利申请号61/521，153)。 逆转录病毒、慢病毒等的病毒载体具有相比于非病毒载体高的转基因效率，因此， 是优异的载体，因为它们可以容易产生iPS细胞。然而，因为逆转录病毒和慢病毒被并入染 色体中，所以考虑到iPS细胞的临床应用，它们具有安全性问题。尽管已经报道了通过使用 非病毒载体诸如腺病毒载体、质粒等而无需并入染色体的iPS细胞（非专利文献6-8)，但建 立效率相比于逆转录病毒和慢病毒低。此外，将重编程因子并入染色体的稳定表达株系以 特定频率获得，甚至当使用通常被认为对并入有抗性的附加型载体时，这可能是由于在选 择iPS细胞下所要求的重编程因子的持续高表达（非专利文献7和9)。 另一方面，使用在染色体外可稳定且自主复制的附加型载体的方法显示上述iPS 细胞建立的低效率，由于药物选择中止而导致载体的自发消失的低频率，并且需要长时间 (非专利文献8)。因此，期望在短时间内有效去除载体连同改进iPS细胞建立效率的方 法。在这方面，本专利技术人发现了从细胞迅速脱落的早期自消失载体，并且已经报道了该载体 (专利文献3、非专利文献4和美国临时专利申请号61/521，153)。 然而，与使用其它载体的方法相比，使用附加型载体的方法与从特定细胞（例如， 血细胞）的极低iPS细胞建立效率的问题相关。由于血细胞是非常可用于构建iPS细胞库 的体细胞来源之一，所以能够有效建立iPS细胞的附加型载体方法，不论细胞种类，一直是 期望的。 [文献列表] [专利文献] 专利文献 I: WO 2007/069666 专利文献 2: WO 2008/118820 专利文献 3: WO 2011/016588 专利文献 4: WO 2011/102531 [非专利文献] 非专利文献 I: Takahashi, K.和 Yamanaka, S·，Cell, 126: 663-676 (2006) 非专利文献 2: Takahashi, Κ·等人，Cell, 131: 861-872 (2007) 非专利文献 3: Yu, J.等人，Science, 318: 1917-1920 (2007) 非专利文献 4: Okita, Κ·等人，Nature Methods, 8(5)，409-412 (2011) 非专利文献 5: Maekawa, Μ·等人，Nature, 474: 225-229 (2011) 非专利文献 6: Stadtfeld, Μ·等人，Science, 322: 945-949 (2008) 非专利文献 7: Okita, Κ·等人，Science, 322: 949-953 (2008) 非专利文献 8: Yu, J.等人，Science, 324: 797-801 (2009) 非专利文献 9: Kaji, Κ·等人，Nature, 458: 771-775 (2009)。 专利技术概述 本专利技术待解决的问题 鉴于上述情况，本专利技术旨在有效建立适合于临床应用的安全人iPS细胞。因此，本专利技术 的第一个问题是提供改进iPS细胞特别是人iPS细胞的建立效率的工具，和使用该工具有 效产生iPS细胞的方法。本专利技术的第二个问题是提供从血细胞有效建立iPS细胞，从而能 够非侵入性获得用于应用于再生医学的体细胞来源的方法。 解决问题的方式 本专利技术人已经进行了深入研究，以试图解决上述问题，并且首次发现，iPS细胞建立效 率可以通过在iPS细胞建立步骤中使用含有编码核重编程因子的核酸的附加型载体连同 含有编码EBNA-I的核酸的附加型载体（下文也被称为额外EBNA-I载体其不同于上 述载体）而显著增强。此外，本专利技术人已经首次发现，iPS细胞可以通过使用所述方法从血 细胞有效建立，尽管这对于传统方法极其困难的。本专利技术基于已经此类发现得以完成。 相应地，本专利技术包括下述内容。 [1]产生iPS细胞的方法，其包括将以下⑴和⑵引入体细胞的步骤： (1) 含有编码核重编程因子的核酸的一种或多种附加型载体；和 (2) 不同于（1)的含有编码EBNA-I的核酸的附加型载体。 [2] [1]的方法，其进一步包括引入以附加型载体形式的编码P53功能的抑制剂 的核酸。 [3] [2]的方法，其中前述P53功能的抑制剂是p53 ShRNA或P53的显性失活突变 体。 [4] [3]的方法，其中前述p53的显性失活突变体是P53DD。 [5] [1]-[4]中任一项的方法，其中前述核重编程因子是选自Oct家族、Klf家族、 Sox家族、Myc家族、Lin家族和Glis家族的成员的一种或多种。 [6][5]的方法，其中前述核重编程因子是0(^3/4、1(1€4、5(?2、1^-]\^(3和1^1128。 [7] [6]的方法，其中前述核重编程因子是0ct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、Lin28和 Glisl。 [8] [l]-[7]中任一项的方法，其中将前述编码核重编程因子的核酸分开并包含 在2或3个附加型载体中。 [9] [1]的方法，其中前述含有编码核重编本文档来自技高网...

【技术保护点】
产生iPS细胞的方法，其包括将以下(1)和(2)引入体细胞的步骤：(1) 含有编码核重编程因子的核酸的一种或多种附加型载体；和(2) 不同于(1)的含有编码EBNA‑1的核酸的附加型载体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.05.23 US 61/6506941. 产生iPS细胞的方法，其包括将w下（1)和（2)引入体细胞的步骤： (1) 含有编码核重编程因子的核酸的一种或多种附加型载体；和 (2) 不同于（1)的含有编码邸NA-1的核酸的附加型载体。2. 根据权利要求1的方法，其进一步包括引入W附加型载体形式的编码p53功能的抑 制剂的核酸。3. 根据权利要求2的方法，其中所述p53功能的抑制剂是p53 shRNA或p53的显性失 活突变体。4. 根据权利要求3的方法，其中所述p53的显性失活突变体是p53孤。5. 根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述核重编程因子是选自Oct家族、Klf家 族、Sox家族、Myc家族、Lin家族和Glis家族的成员的一种或多种。6. 根据权利要求5的方法，其中所述核重编程因子是0ct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc和 Lin28。7. 根据权利要求6的方法，其中所述核重编程因子是0ct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、Lin28 和 Glisl。8. 根据权利要求1-7中任一项的方法，其中将所述编码核重编程因子的核酸分开并包 含在2或3个附加型载体中。9. 根据权利要求1的方法，其中所述含有编码核重编程因子的核酸的附加型载体是 pC邸-hSK-0 和 pC邸-h化-G。10. 根据权利要求1的方法，其中所述含有编码核重编程因子的核酸的附加型载体是 pCXLE-hOCT3/4、pCXLE-hSK 和 pCXLE-h化。11. 根据权利要求2的方法，其中所述含有编码核重编程因子的核酸的附加型载体是 pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK 和 pCXLE-h化。12. 根据权利要求2的方法，其中所述含有编码核重编程因子的核酸的附加型载体是 pCE-hOCT3/4-shp53、pCE-hSK 和 pCE-h化。13. 根据权利要求2的方法，其中所述含有编码核重编程因子的核酸的附加型质粒载 体是pCE-hOCT3/4、pCE-hSK和pCE-h化，且所述含有编码p53功能的抑制剂的核酸的附加 型载体是pCE-mp53孤。14. 根据权利要求9-11中任一项的方法，其中所述含有编码邸NA-1的核酸的质粒载体 是 pCXWB-邸NA1。15. 根据权利要求12或13的方法，其中所述含有编码邸NA-1的核酸的质粒载体是 pCXB-EBNAlo16. 根据权利要求1-15中任一项的方法，其中所述体细胞选自人成纤维细胞（皿巧和 血细胞。17. 根据权利要求16的方法，其中所述血细胞是外周血单核细胞（PMNC)。18. ...

【专利技术属性】
技术研发人员：山中伸弥，冲田圭介，
申请(专利权)人：国立大学法人京都大学，
类型：发明
国别省市：日本;JP