导入SV40LT和hTERT重组基因构建神经管缺陷细胞模型及其细胞库制造技术

本发明专利技术涉及出生缺陷干预领域的导入SV40LT和hTERT重组基因构建神经管缺陷细胞模型及其细胞库，其主要特征是以T4DNA连接经BamHI酶切质粒SV40LTag DNA及载体pcDNA3.1(-)DNA的产物，构建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重组子；并以Ligation Mix连接经EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo-hTERT和载体pLXSNneo的产物，构建pLXSNneo-hTERT重组子，两重组子经感受态细胞扩增纯化和鉴定后转染入神经管缺陷细胞，经G418筛选含阳性重组子的细胞克隆并扩大培养，筛选符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT和hTERT重组基因介导的神经管缺陷体外研究细胞模型，为从细胞水平在体外长期研究其发病机制奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
导入SV40LT和hTERT重组基因构建神经管缺陷细胞模型及其细胞库
本专利技术涉及导入SV40LT (猴肾病毒40大T抗原基因)和hTERT (端粒酶逆转录酶催化亚基)重组基因(SV40LT和hTERT介导)构建神经管缺陷细胞模型及其细胞库的方法，主要用于出生缺陷干预研究领域，为神经管缺陷的体外研究提供细胞模型并保存其科研资源。
技术介绍
神经管缺陷又名神经管畸形，是一种常见而严重的先天缺陷。神经管是胎儿的中枢神经系统，在胚胎的第15-17日开始，神经系统开始发育，至胚胎22日左右，神经褶的两侧开始互相靠拢，形成1个管道，称为神经管，它的前端称为神经管前孔，尾端称为神经管后孔，胚胎在24-25日及26日时，前孔及后孔相继关闭。胎儿神经管畸形主要表现为无脑儿、脑膨出、脑脊髓膜膨出、隐性脊柱裂、唇裂及腭裂、开放性脊柱裂、闭合性脊柱裂等。 有研究表明，人类大脑是在神经管上发育而形成的，如在妊娠3-4周起至4个月，孕妇缺乏叶酸，便可能导致胎儿出现不同程度的神经系统先天性畸形。许多种类基因的表达或突变与神经系统发育、神经管畸形有关，这些基因是转录因子，包括①发育调节基因及转录因子类基因。②原癌基因和抑癌基因。③生长因子及其受体基因。④蛋白激酶C相关基因。⑤同型半胱氨酸代谢相关基因。⑥其他基因:细胞骨架类、细胞连接类基因等。神经管畸形发生的重要因素是妊娠期间孕妇体内缺乏叶酸，因此孕妇在孕前1个月至孕后4个月内，每日口服1次叶酸0.4毫克，就可使胎儿神经管畸形发生率降低70%。尽管如此，神经管畸形的发病机制、如何更好地预防、干预或治疗，还有待于更进一步的研究。 但是，由于没有理想的可在体外长期培养的、可用于发病机制研究的永生细胞模型及其细胞库，就难以从细胞水平在体外研究神经管缺陷细胞受物理、化学、生物、遗传等影响的基因突变、基因表达、功能改变、生理特性、生物传导等机制，从而严重限制了神经管缺陷的进一步研究。 国外文献报道，猴肾病毒40 (SV40)可以使某些人类细胞发生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的导入能加快转化细胞的生长速率，永生化细胞在体外多次传代后，仍具有相对稳定的增殖特性和功能状态，同时也能保留其原始细胞的许多分化表型，可以用于转基因动物模型及人类和动物某些种类的细胞模型的建立，据此可以借助于研究转基因永生化细胞及动物模型而在体外研究原始细胞的特性，从而研究其发病机制。 但国外最近有研究发现,SV40Tag转染的细胞伴随着DNA损伤修复机制的丢失、核型的不稳定性以及少数细胞致瘤性转化。此外，长期体外培养发现部分转染SV40Tag的细胞只是延长了寿命，或仅仅渡过了衰老期(MI期)，多数细胞会最终进入危机期(M2期)而死亡，说明细胞并未获得永生化。同时SV40病毒具有致瘤性，与某些肿瘤的发生、发展有关，因此SV40Tag转染的细胞对某些研究也存在一定程度的限制性。 国外研究表明，导入外源性hTERT可以使细胞保持正常表型及分化特征。近年来已利用hTERT成功建立了某些细胞的永生化细胞系，基本保持染色体稳定、分化正常、接触抑制、无致瘤性等相对“正常”的生长特征。可以用于人类和动物某些种类的细胞模型的建立，对借助于研究转基因永生化细胞模型而研究原始细胞的特性，从而研究其发病机制，具有重要的意义。在口腔医学领域，日本学者Kamata、Fujita和Fujii转染hTERT建立了永生化人牙龈成纤维细胞、牙周细胞、牙髓细胞系和牙囊细胞系，细胞群体倍增数达150次以上，细胞均表现原有的生物学特性，诱导培养后都可以表达来源细胞的相关蛋白。Kitagawa等转染hTERT建立了人成牙骨质细胞系，细胞倍增达200次以上，细胞分化标志物如碱性磷酸酶、I型胶原等表达稳定。因研究工作的需要，几乎每种疾病都有各自的细胞模型。如糖尿病细胞模型、癌细胞细胞模型、转基因细胞模型、绝经期综合症细胞模型、子宫内膜细胞模型、癫痫细胞模型、电子细胞模型、酒精性痴呆细胞模型、脑水肿细胞模型。等等。 另有国外研究表明，人体组织细胞在体外培养时会在较短时间内死亡而无法传代，即在进入衰老期(Ml期)前就会死亡。但猴肾病毒40(SV40)可以使某些人类细胞发生永生化，可使细胞渡过Ml期后继续存活、传代培养20-30代，然后细胞又会进入危机期(M2期)，细胞死亡率增加并伴染色体异常，分裂的细胞逐渐减少，绝大多数细胞发生死亡。而hTERT可以维持细胞染色体端粒的稳定，从而使细胞渡过危机期(M2期)，可继续存活、传代达100-300代以上。所以如果用SV40和hTERT同时转染人离体组织细胞建立永生化细胞系，那么SV40可以使细胞渡过Ml期，hTERT可以使细胞渡过M2期，比单独使用其中之一建立的细胞系更稳定、寿命更长。 但是，至今尚未见有关以猴肾病毒40大T抗原基因(SV40LT)和端粒酶逆转录酶催化亚基(hTERT)同时导入细胞以建立永生细胞系并以此构建可用于在体外从细胞水平研究神经管缺陷发病机制的永生细胞模型及其细胞库的文献报道，也无法开展相关项目的研究。为了解决这一问题，本专利技术人提出了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是要提供导入SV40LT和hTERT重组基因(SV40LT和hTERT介导)构建神经管缺陷细胞模型及其细胞库的方法，另一目的是为在体外从细胞水平研究神经管缺陷的发病机制提供SV40LT和hTERT介导神经管缺陷细胞模型及其细胞库。 本专利技术的目的是这样实现的:以T4DNA连接经BamHI酶切质粒SV40LTag DNA及载体 pcDNA3.1 (-)DNA 的产物，构建 SV40LTag-pcDNA3.1(-)重组子；并以 Ligat1nMix连接经EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo-hTERT和载体pLXSNneo的产物，构建pLXSNneo-hTERT重组子，两重组子经感受态细胞扩增纯化和鉴定后以脂质体转染入神经管缺陷组织细胞，经G418筛选含阳性重组子的细胞克隆并扩大培养，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达产物、免疫组织化学染色、细胞增殖周期及细胞凋亡率符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT和hTERT介导神经管缺陷体外研究细胞模型冻存于液氮中，为从细胞水平在体外长期研究其发病机制奠定基础。 本专利技术以PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳提纯SV40LT和hTERT，分别经基因载体pcDNA3.1(-)DNA和pLXSNneo以脂质体转染法导入神经管缺陷细胞而构建其细胞模型，其组织细胞用0.01%胶原酶II消化而不用常规的胰蛋白酶消化，以仅使引起细胞粘连的胶原被消化或使细胞悬浮，减少了细胞壁的蛋白质被消化而伤及细胞，使细胞培养的成功率由一般的约85%提高到95%以上；选用了含20mL / L胎牛血清、5?lOnmol / L胰岛素的特定培养基，使细胞不会生长过快而影响hTERT基因的整合，也不会因缺少营养或细胞生长刺激因子而使细胞在未达到要求的汇合率、未进入对数生长期前就过早死亡，或对数生长期缩短；制备的细胞系在_196°C液氮中冻本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于医学领域的导入SV40LT和hTERT重组基因构建神经管缺陷细胞模型及其细胞库的方法，其主要特征是以T4DNA连接经BamHI酶切质粒SV40LTag DNA及载体pcDNA3.1(‑)DNA的产物，构建SV40LT‑pcDNA3.1(‑)重组子；并以Ligation Mix连接经EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo‑hTERT和载体pLXSNneo的产物，构建pLXSNneo‑hTERT重组子，两重组子经感受态细胞扩增纯化和鉴定后以脂质体转染导入神经管缺陷组织细胞，经G418筛选含阳性重组子的细胞克隆并扩大培养，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达产物、免疫组织化学染色、细胞增殖周期及细胞凋亡率符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT和hTERT介导神经管缺陷体外研究细胞模型冻存于液氮中，为从细胞水平在体外长期研究其发病机制奠定基础。

【技术特征摘要】
1.一种用于医学领域的导入SV40LT和hTERT重组基因构建神经管缺陷细胞模型及其细胞库的方法，其主要特征是以T4DNA连接经BamHI酶切质粒SV40LTag DNA及载体pcDNA3.1(-)0嫩的产物，构建5￥401^1。0嫩3.I (-)重组子；并以Ligat1n Mix连接经EcoRI和Xho I双酶切质粒pCIneo-hTERT和载体pLXSNneo的产物，构建pLXSNneo-hTERT重组子，两重组子经感受态细胞扩增纯化和鉴定后以脂质体转染导入神经管缺陷组织细胞，经G418筛选含阳性重组子的细胞克隆并扩大培养，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达产物、免疫组织化学染色、细胞增殖周期及细胞凋亡率符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT和hTERT介导神经管缺陷体外研究细胞模型冻存于液氮中，为从细胞水平在体外长期研究其发病机制奠定基础。2.根据权利要求1所述的导入SV40LT和hTERT重组基因构建神经管缺陷细胞模型及其细胞库的方法，其特征是所指细胞模型为(I)细胞在倒置光学显微镜下呈梭形或小园形的上皮细胞样贴壁生长；(2)细胞的生长曲线如以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴，在hepato ZYME—SFM无血清培养基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(3)为神经管缺陷细胞，染色体核型为二倍体“46，XX”或“46，XY”，或相同于本发明采集的原代细胞；(4)细胞不能在软琼脂内生长(形成克隆)；(5)细胞为非恶化细胞，裸鼠致瘤试验阴性；(6)细胞的DNA中同时整合了 SV40LT和hTERT基因，同时表达SV40LT和hTERT基因的mRNA产物；(7)细胞传代至第126代、培养至第7天时，呈对数生长、圆形、梭形、铺满瓶底，其细胞生长汇合率达90%以上，此后随着传代次数的增加，细胞生长变慢、变稀疏；(8)能反复冻溶、传代126代以上；(9)用于研究神经管缺陷的病理机制；(10)可再生性地保存SV40LT和hTERT同时整合的神经管缺陷的遗传资源。3.根据权利要求1所述的导入SV40LT和hTERT重组基因构建神经管缺陷细胞模型及其细胞库的方法，其特征是取自因其他实验所需而采集的、并在其他实验后多余、废弃的神经管缺陷患儿...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁炳焕，罗玉琴，孙义锡，李晓，杨燕梅，黄荷凤，
申请(专利权)人：翁炳焕，
类型：发明
国别省市：浙江;33