SV40LT和hTERT基因转导构建Turner综合征细胞模型及其细胞库制造技术

本发明专利技术涉及医学领域的SV40LT和hTERT基因转导构建Turner综合征细胞模型及其细胞库，其主要特征是以T4DNA连接经BamHI酶切质粒SV40LTag DNA及载体pcDNA3.1(-)DNA的产物，构建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重组子；并以Ligation Mix连接经EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo-hTERT和载体pLXSNneo的产物，构建pLXSNneo-hTERT重组子，两重组子经感受态细胞扩增纯化和鉴定后转染入Turner综合症组织细胞，G418筛选阳性细胞克隆并扩大培养，筛选符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT和hTERT介导的Turner综合症体外研究细胞模型，为从细胞水平在体外长期研究其发病机制奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
SV40LT和hTERT基因转导构建Turner综合征细胞模型及其细胞库
本专利技术涉及SV40LT (猴肾病毒40大T抗原基因)和hTERT (端粒酶逆转录酶催化亚基)基因转导(SV40LT和hTERT介导)构建Turner综合征细胞模型及其细胞，主要用于生殖遗传研究领域，为Turner综合征的体外研究提供细胞模型并保存其科研资源。
技术介绍
Turner综合征表现为女性缺少一条X染色体所致的身材矮小、原发性闭经、颈蹼、肘外翻、第二特征发育不良、卵巢缺如、无生育能力等异常。部分患者智力轻度低下，或伴有心、肾、骨骼等先天畸形。本病由Turner于1938年报道,故称为Turner综合征。本病患者不可能建立生育功能。为了第二性征的发育和维持，可长期应用雌激素替代疗法，但有诱发骨质疏松、子宫内膜癌的危险，一旦出生，就会给社会、家庭和本人造成较严重的心理负担和精神痛苦，影响我国的人口质量，已成为社会可持续发展的障碍。 文献报道，本病的发生与物理、化学、生物、遗传及个体自身免疫性疾病等因素有关。但是，由于没有可在体外长期培养的、可用于本病发病机制研究的永生细胞模型及其细胞库，就难以从细胞水平在体外研究Turner综合征细胞受物理、化学、生物、遗传等影响的基因突变、基因表达、功能改变、生理特性、生物传导等机制，从而严重限制了 Turner综合征的进一步研究。 国外文献报道，猴肾病毒40 (SV40)可以使某些人类细胞发生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的导入能加快转化细胞的生长速率，永生化细胞在体外多次传代后，仍具有相对稳定的增殖特性和功能状态，同时也能保留其原始细胞的许多分化表型，可以用于转基因动物模型及人类和动物某些种类的细胞模型的建立，据此可以借助于研究转基因永生化细胞及动物模型而在体外研究原始细胞的特性，从而研究其发病机制。 但国外最近有研究发现，SV40Tag转染的细胞伴随着DNA损伤修复机制的丢失、核型的不稳定性以及少数细胞致瘤性转化。此外，长期体外培养发现部分转染SV40Tag的细胞只是延长了寿命，或仅仅渡过了衰老期(MI期)，多数细胞会最终进入危机期(M2期)而死亡，说明细胞并未获得永生化。同时SV40病毒具有致瘤性，与某些肿瘤的发生、发展有关，因此SV40Tag转染的细胞对某些研究也存在一定程度的限制性。 国外研究表明，导入外源性hTERT可以使细胞保持正常表型及分化特征。近年来已利用hTERT成功建立了某些细胞的永生化细胞系，基本保持染色体稳定、分化正常、接触抑制、无致瘤性等相对“正常”的生长特征。可以用于人类和动物某些种类的细胞模型的建立，对借助于研究转基因永生化细胞模型而研究原始细胞的特性，从而研究其发病机制，具有重要的意义。在口腔医学领域，日本学者Kamata、Fujita和Fujii转染hTERT建立了永生化人牙龈成纤维细胞、牙周细胞、牙髓细胞系和牙囊细胞系，细胞群体倍增数达150次以上，细胞均表现原有的生物学特性，诱导培养后都可以表达来源细胞的相关蛋白。Kitagawa等转染hTERT建立了人成牙骨质细胞系，细胞倍增达200次以上，细胞分化标志物如碱性磷酸酶、I型胶原等表达稳定。因研究工作的需要，几乎每种疾病都有各自的细胞模型。如糖尿病细胞模型、癌细胞细胞模型、转基因细胞模型、绝经期综合症细胞模型、子宫内膜细胞模型、癫痫细胞模型、电子细胞模型、酒精性痴呆细胞模型、脑水肿细胞模型。等等。 另有国外研究表明，人体组织细胞在体外培养时会在较短时间内死亡而无法传代，即在进入衰老期(Ml期)前就会死亡。但猴肾病毒40(SV40)可以使某些人类细胞发生永生化，可使细胞渡过Ml期后继续存活、传代培养20-30代，然后细胞又会进入危机期(M2期)，细胞死亡率增加并伴染色体异常，分裂的细胞逐渐减少，绝大多数细胞发生死亡。而hTERT可以维持细胞染色体端粒的稳定，从而使细胞渡过危机期(M2期)，可继续存活、传代达100-300代以上。所以如果用SV40和hTERT同时转染人离体组织细胞建立永生化细胞系，那么SV40可以使细胞渡过Ml期，hTERT可以使细胞渡过M2期，比单独使用其中之一建立的细胞系更稳定、寿命更长。 但是，至今尚未见有关以猴肾病毒40大T抗原基因(SV40LT)和端粒酶逆转录酶催化亚基(hTERT)同时导入细胞以建立永生细胞系并以此构建可用于在体外从细胞水平研究Turner综合征发病机制的永生细胞模型及其细胞库的文献报道，也无法开展相关项目的研究。为了解决这一问题，本专利技术人提出了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是要提供SV40LT和hTERT基因转导构建Turner综合征细胞模型及其细胞库的方法，另一目的是为在体外从细胞水平研究Turner综合征的发病机制提供SV40LT和hTERT基因转导构建的Turner综合征细胞模型及其细胞库。 本专利技术的目的是这样实现的:以T4DNA连接经BamHI酶切质粒SV40LTag DNA及载体 pcDNA3.1 (-)DNA 的产物，构建 SV40LTag-pcDNA3.1(-)重组子；并以 Ligat1nMix连接经EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo-hTERT和载体pLXSNneo的产物，构建pLXSNneo-hTERT重组子，两重组子经感受态细胞扩增纯化和鉴定后以脂质体转染入Turner综合征组织细胞，经G418筛选含阳性重组子的细胞克隆并扩大培养，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达产物、免疫组织化学染色、细胞增殖周期及细胞凋亡率符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT和hTERT介导Turner综合征体外研究细胞模型冻存于液氮中，为从细胞水平在体外长期研究其发病机制奠定基础。 本专利技术以PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳提纯SV40LT和hTERT，分别经基因载体pcDNA3.1 (-)DNA和pLXSNneo以脂质体转染法导入Turner综合征细胞而构建其细胞模型，其组织细胞用0.01%胶原酶II消化而不用常规的胰蛋白酶消化，以仅使引起细胞粘连的胶原被消化或使细胞悬浮，减少了细胞壁的蛋白质被消化而伤及细胞，使细胞培养的成功率由一般的约85%提高到95%以上；选用了含20mL/L胎牛血清、5?lOnmol/L胰岛素的特定培养基，使细胞不会生长过快而影响hTERT基因的整合，也不会因缺少营养或细胞生长刺激因子而使细胞在未达到要求的汇合率、未进入对数生长期前就过早死亡，或对数生长期缩短；制备的细胞系在_196°C液氮中冻存1个月后复苏培养，均能生长出贴壁细胞；在作细胞系染色体鉴定时，秋水仙素的用量及作用时间是常规的5?10倍，使染色体分裂相增加，足以计数和分析；此外，用SV40LT和hTERT同时转染人离体组织细胞建立永生化细胞系，SV40可以使细胞渡过Ml期，hTERT可以使细胞渡过M2期，比单独使用其中之一建立的细胞系更稳定、寿命更长。 【附图说明】 图1是本专利技术制备的Turner综合征细胞模型(贴壁生长)图。 如图1，细胞传代至第18本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于医学领域的SV40LT和hTERT基因转导构建Turner综合征细胞模型及其细胞库的方法，其主要特征是以T4DNA连接经BamHI酶切质粒SV40LTag DNA及载体pcDNA3.1(‑)DNA的产物，构建SV40LT‑pcDNA3.1(‑)重组子；并以Ligat ion Mix连接经EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo‑hTERT和载体pLXSNneo的产物，构建pLXSNneo‑hTERT重组子，两重组子经感受态细胞扩增纯化和鉴定后以脂质体转染导入Turner综合症组织细胞，经G418筛选含阳性重组子的细胞克隆并扩大培养，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达产物、免疫组织化学染色、细胞增殖周期及细胞凋亡率符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT和hTERT基因转导构建的Turner综合症体外研究细胞模型冻存于液氮中，为从细胞水平(替代人体或动物直接试验)在体外长期研究其发病机制奠定基础。

【技术特征摘要】
1.一种用于医学领域的SV40LT和hTERT基因转导构建Turner综合征细胞模型及其细胞库的方法，其主要特征是以T4DNA连接经BamHI酶切质粒SV40LTag DNA及载体pcDNA3.1 (-) DNA 的产物，构建 SV40LT-pcDNA3.1 (-)重组子；并以 Ligat 1n Mix 连接经EcoR I 和 Xho I 双酶切质粒 pCIneo-hTERT 和载体 pLXSNneo 的产物，构建 pLXSNneo-hTERT重组子，两重组子经感受态细胞扩增纯化和鉴定后以脂质体转染导入Turner综合症组织细胞，经G418筛选含阳性重组子的细胞克隆并扩大培养，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达产物、免疫组织化学染色、细胞增殖周期及细胞凋亡率符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT和hTERT基因转导构建的Turner综合症体外研究细胞模型冻存于液氮中，为从细胞水平(替代人体或动物直接试验)在体外长期研究其发病机制奠定基础。2.根据权利要求1所述的SV40LT和hTERT基因转导构建Turner综合征细胞模型及其细胞库的方法，其特征是所指细胞模型为(I)细胞在倒置光学显微镜下呈梭形或小园形的上皮细胞样贴壁生长；(2)细胞的生长曲线如以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴，在hepato ZYME-SFM无血清培养基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(3)染色体核型为“45，X”，或相同于本发明采集的原代Turner综合征细胞核型；(4)细胞不能在软琼脂内生长(不形成克隆)；(5)细胞为非恶化细胞，裸鼠致瘤试验阴性；(6)细胞的DNA中同时整合了 SV40LT和hTERT基因，同时表达SV40LT和hTERT基因的mRNA产物；(7)细胞传代至第185代、培养至第10天时，呈对数生长、圆形、梭形、铺满瓶底，其细胞生长汇合率达85%以上，此后随着传代次数的增加，细胞生长变慢、变稀疏；(8)能反复冻溶、传代培养185代以上；(9)作为细胞模型用于体外从细胞水平研究Turner综合征的病理机制；(10)可再生性地保存SV40LT和hTERT同时整合的Turner综合征的遗传资源；(11)用于实验对照及质控细胞。3.根据权利要求1所述的SV40LT和hTERT基因转导构建Turner综合征细胞模型及其细胞库的方法，其特征是取自因其他实验...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁炳焕，马袁英，朱瑞建，卢欢明，毛愉婵，金帆，
申请(专利权)人：翁炳焕，
类型：发明
国别省市：浙江;33