一种大型海藻离体染色表皮片层的快速制片方法技术

一种大型海藻离体染色表皮片层的快速制片方法，步骤包括混合试剂配制、一步完成离解并染色大型海藻表皮细胞层，人工操作快速制成面积可达1cm2的表皮细胞片层。本发明专利技术操作简便、制作速度快、显色效果和稳定性好，适用于显微镜和电镜观测以及表皮细胞超微结构观察与研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物体显微和超微结构研究中的制片方法，尤其是一种大型海藻 离体染色表皮片层的快速制片方法。
技术介绍
显微和超微结构研究是揭示生命现象和过程的必需手段，从荷兰科学家虎克专利技术 显微镜以来已经有300多年，取得了许多进步，但该领域的研究往往受到样品处理过程中 制片技术的好坏所影响。大型海藻，是海洋中的大型低等植物，其长度从几毫米至几十米，常见的一般大多 属于厘米级，粗度一般也就几毫米长，常见的大型海藻体积都比较小。那么，开展其显微和 超微结构研究已成了对其进行精确鉴定、分类和生命活动等研究必不可少的一个环节。然 而，针对多数如此小的生物，进行其显微和超微结构研究在制片上存在很大难度，特别是针 对其表皮细胞的难度更大，因此目前现有的制片方法大多都是直接来源于高等植物。过去 该领域的学者主要从两个方面进行染色观察1.制作切片后染色观察；2.样品表面直接 观察。这些方法存在明显的不足1.切片只能观察到部分组织和结构，不能显现观察对象 的全貌；2.通过表面直接观察，由于其内部有其它组织细胞，导致观察结果往往受到干扰； 3.无论是切片还是表面观察，其超微观察结果通常不好，无法获得所需组织结构的清晳照 片等图像信息。我们在开展大型海藻的研究过程中，经常碰到此类问题，也曾寻找文献，都未能解 决这个问题。如何有效地分离大型海藻的表皮层，成为了学科发展的一个难题。迄今为止， 尚未见到任何有关利用试剂特性来解离大型海藻表皮制片的报道。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种大型海藻离体染色表皮片层的快速 制片方法。，包括如下步骤(1)配制苯胺蓝染色混合试剂母液配制比例为乳酸苯酚甘油水=1:1 :1 :1，然后以母液为基础配制O. 5%(w/v)苯胺蓝染色混合试剂；(2)选取样品选择目标样品并进行清洁，去除藻体表面的杂质和杂藻，切成长约I一1. 5cm的样品段；(3)染色及表皮细胞层解离取多数样品，加入步骤(I)制得的混合试剂，一般4一8根 样品加入混合试剂I滴，正常处理样品的处理时间为10 —12分钟，幼嫩组织的处理时间为 3— 4分钟，让样品表皮细胞层与内皮层细胞间充分解离并染色；(4)染色表皮片层的分离切开表皮层，移去内部组织，可制成面积可达Icm2的染色表 皮细胞片层；(5)染色表皮片层制片染色表皮片层移置预先准备的载玻片，加保湿防腐剂，封片。在步骤(I)中，先将苯酚、乳酸、甘油和水的混合过程中进行加热。在步骤(2)中，在超声波清洗仪中处理样品8-10分钟，幼嫩组织处理3-4分钟，用 洁净海水冲洗样品，镜检清洗效果。在步骤(3)中，挑选藻体表面干净、均匀的样品，置于凹形玻片中，加入1-2滴苯胺 蓝溶液，翻动样品，使之均匀着色；针对样品表皮细胞与内皮层细胞质地和致密性差异，利 用苯酚的腐蚀性特点，解离表皮与内皮层细胞间的粘质和胞间连结。在步骤(4)中，左手用尖镊子轻压样品内部组织部分，右手用解剖针轻轻从左至右 划开表皮细胞层，用软毛笔移去内部组织，可制成面积可达I Cm2的染色表皮细胞片层。本专利技术的优点和积极效果如下I)能精确分离出表皮细胞层。2)所制备的表皮片层面积大,适合多种用途。3)制片速度快，花费极少，经济适用。4)表皮细胞不变形。5)染色效果好，不易退色。6)具有杀菌防腐作用，能较长时间保存。本专利技术是一种大型海藻离体染色表皮片层的快速制备方法，通过此种方法制备的 大型海藻表皮片层不但具有明显的结构特征一超微结构清皙，细胞不变形，而且可展现连 续的形态结构差异，在形态学、解剖学、发育学及进化研究方面具有重要的应用价值。具体实施方式下面对本专利技术作进一步详述，但不构成对本专利技术保护范围的限制。本专利技术一方面 是通过混合试剂中苯胺蓝对样品进行染色，另一方面根据大型海藻表皮层和内皮层质地和 致密性存在差异的特性，利用苯酚的腐蚀性解离胞间粘质及其连结，达到表皮层和内皮层 分离的目的。实施例1 :大型海藻成熟表皮片层的制备(I)选取样品的成体部分，用毛刷和超声波清洗仪清洁藻体表面2-3次，超声波清洗仪 处理样品一般每次8-10分钟,去除藻体表面的杂质和杂藻,切成长约1-1. 5 cm左右的样品 段，挑选其中生长均匀、粗细适中、分枝较少的样品用于后续操作。(2)把清洁、切段的样品转入载玻片凹槽中或小的培养皿或小烧杯中，一般按4根 样品加入混合试剂I滴，处理样品10-12分钟，每隔3-4分钟翻动样品一次，让样品表皮细 胞层与内皮层细胞间充分解离并染色。(3)染色及解离的样品转入小烧杯中，用蒸馏水清洗样品3-4次，去除样品表面混 合试剂，左手用尖镊子轻压样品内部组织部分，右手用解剖针轻轻从一端至另一端划开表 皮层，然后用镊子轻轻固定样品一端，再用细毛笔移去解离的内部组织，根据观察需要制成 染色表皮细胞片层，较大的面积可达I cm2。(4)用吸管吸取染色表皮细胞片层，转移到载玻片凹槽中，用蒸馏水清洗2-3次。 准备干净的载玻片，用吸管吸取一个染色表皮片层置于其上，慢慢用镊子和解剖针展开片 层，使之单层平铺于载玻片上。滴加1-2滴封片液,封片。本实施例说明由于成熟藻体生长时间长，其表面附着的杂质和杂藻多且附着比较牢固，因此前处理需要的强度比幼藻体的大，其组织结构致密，所需要进行的染色和解离 时间也较长。由其制成的表皮片层韧性好，利于后续操作和永久封存。实施例2 :大型海藻幼嫩表皮片层的制备(I)选取样品的成体部分，用超声波清洗仪清洁藻体表面I次，处理时间一般3-4分钟， 去除藻体表面的杂质，切成长约1-1.5 cm左右的样品段，挑选其中生长均匀、粗细适中、分 枝较少的样品用于后续操作。(2)把清洁、切段的样品转入载玻片凹槽中或小的培养皿或小烧杯中，一般按8根 样品加入混合试剂I滴，处理样品10分钟，每隔3-4分钟翻动样品一次，让样品表皮细胞层 与内皮层细胞间充分解离并染色。(3)染色及解离的样品转入小烧杯中，用蒸馏水清洗样品2-3次，去除样品表面混 合试剂，左手用尖镊子轻压样品内部组织部分，右手用解剖针轻轻从一端至另一端划开表 皮层，然后用镊子轻轻固定样品一端，再用细毛笔移去解离的内部组织，根据观察需要制成 染色表皮细胞片层。(4)用吸管吸取染色表皮细胞片层，转移到载玻片凹槽中，用蒸馏水清洗1-2次。 准备干净的载玻片，用吸管吸取一个染色表皮片层置于其上，慢慢用镊子和解剖针展开片 层，使之单层平铺于载玻片上。滴加1-2滴封片液,封片。本实施例说明由于幼嫩藻体生长时间短，其表面组织幼嫩，附着的杂质较少，杂 藻一般没有或很少且附着不牢固，因此前处理的强度要小，其组织致密性不够强，所需要进 行的染色和解离时间也稍短，各类操作也应更轻缓，以免样品组织过度解离而导致表皮层 小片状脱落，不易制得较大面积的表皮片层。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大型海藻离体染色表皮片层的快速制片方法，包括如下步骤：（1）配制苯胺蓝染色混合试剂：母液配比为：乳酸︰苯酚︰甘油︰水=1︰1︰1︰1，然后以母液为基础配制0.5%(w/v)苯胺蓝染色混合试剂；（2）选取样品：选择目标样品并进行清洁，去除藻体表面的杂质和杂藻，切成长约1—1.5cm的样品段；（3）染色及表皮细胞层解离：取多数样品，加入步骤（1）制得的混合试剂，一般4—8根样品加入混合试剂1滴，处理正常样品的处理时间为10—12分钟，幼嫩组织的处理时间为3—4分钟，让样品表皮细胞层与内皮层细胞间充分解离并染色；（4）染色表皮片层的分离：切开表皮层，移去内部组织，可制成面积可达1?cm2的染色表皮细胞片层；（5）染色表皮片层制片：染色表皮片层移置预先准备的载玻片，加保湿防腐剂，封片。

【技术特征摘要】
1.一种大型海藻离体染色表皮片层的快速制片方法，包括如下步骤 (1)配制苯胺蓝染色混合试剂母液配比为乳酸苯酚甘油水=1:1 :1 : 1，然后以母液为基础配制O. 5% (w/v)苯胺蓝染色混合试剂； (2)选取样品选择目标样品并进行清洁，去除藻体表面的杂质和杂藻，切成长约I一1.5cm的样品段； (3)染色及表皮细胞层解离取多数样品，加入步骤(I)制得的混合试剂，一般4一8根样品加入混合试剂I滴，处理正常样品的处理时间为10 —12分钟，幼嫩组织的处理时间为3— 4分钟，让样品表皮细胞层与内皮层细胞间充分解离并染色； (4)染色表皮片层的分离切开表皮层，移去内部组织，可制成面积可达Icm2的染色表皮细胞片层； (5)染色表皮片层制片染色表皮片层移置预先准备的载玻片，加保湿防腐剂，封片。2.根据权利要求1所述的大型海藻离体染色表皮片层的快速制片方法，其特征是在步骤(I)中先将苯酚、乳酸、甘油和水的混合过程中进行加热。3.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁兰平，黄冰心，
申请(专利权)人：汕头大学，
类型：发明
国别省市：