本发明专利技术公开了一种重组人胰岛素的工业制备方法，包括以下步骤：步骤S100：制备菌种；步骤S200：培养菌种；步骤S300：包涵体的收集；步骤S400：RRhPI初步纯化；步骤S500：RRhPI重组复性；步骤S600：酶切转化；步骤S700：hI的纯化；步骤S800：hI成品。本发明专利技术简化工艺流程，提高生产效率，改进产品品质，适应工业制备需求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，具体是指。
技术介绍
随着生物技术的迅猛发展，基因工程重组人胰岛素面世，较动物来源胰岛素优势更加明显，与人体内胰岛素的序列完全一致，且纯度更高，含宿主蛋白少，安全无毒副作用。现有的人胰岛素的制取方法，工序复杂，对原料及设备要求较高，无法适应批量化生产的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，简化工艺流程，提高生广效率，改进广品品质，适应工业制备需求。本专利技术通过下述技术方案实现:，包括以下步骤: 步骤SlOO:制备菌种； 步骤S200:培养菌种； 步骤S300:包涵体的收集；将培养的菌种在-20°C以下冻干，然后用缓冲液A溶解，室温状态下振荡2-4h，固液分离后收集沉淀，得包涵体； 步骤S400:RRhPI初步纯化；将收集的包涵体用缓冲液B完全溶解后，再以缓冲液B与缓冲液C体积比为1:2-1:10添加缓冲液C，使蛋白浓度为0.05-0.5mg/ml，然后上于已用缓冲液B平衡的DEAE-S印harose FF柱，用NaCl梯度洗脱，收集含RRhPI的洗脱液； 步骤S500:RRhPI重组复性；初步纯化后的RRhPI通过Sephadex G-25脱尿素，再转换到缓冲液D中，4°C放置18h以上，得RRhPI复性液； 步骤S600:酶切转化；按胰蛋白酶、羧肽酶B、蛋白的质量比为2:1:2000，向RRhPI复性液中加入胰蛋白酶和羧肽酶B，室温酶切50-80min，然后用0.lmol/L ZnC12终止反应并沉淀生成hi ；步骤S700:hl的纯化；hl的纯化包括粗纯化和精纯化；所述粗纯化时，将步骤S600中的hi通过预置8_12mmol/L的Tris-HCl和0-1.0mmol/L的NaCl的两步柱层析，对hi进行初步提纯得到粗品；所述精纯化时，用10-20mmol/L的色谱乙腈对粗品进行精制得到精品；步骤S800:hl成品；精品再经多次结晶和水洗后进入过滤除菌室，-20°C以下冻干，得到hi成品； 所述步骤SlOO具体是指: 步骤SllO:以人胰腺CDNA文库为模板，用PCR扩增技术提取目的基因； 步骤S120:从用细胞工程培养的大肠杆菌中通过碱裂解法提取环装的pQE-40质粒；步骤S130:分别取出目的基因和pQE-40质粒，分别利用限制性内切酶Bam HI和HindIII同时酶切并产生粘性末端； 步骤S140:在20°C以下，T4DNA连接酶的作用下，将目的基因与pQE_40质粒结合通过粘性末端互补，形成一个能表达胰岛素的重组DNA ; 步骤S150:将含有目的基因的重组DNA放入大肠杆菌的培养液中并加入氯化钙，使大肠杆菌将重组DNA吸收，重组DNA转化E.coli感受态细胞Ml5 ； 所述步骤S200具体是指: 步骤S210:取出步骤SlOO中制备的菌种进行活化； 步骤S220:采用二级发酵方式，恒温振荡2-3h ； 步骤 S230:用 0.5mmol/L 的 IPTG 诱导 RRhPI/pQE40 E.coli M15 菌种表达 RRhPI。进一步地，所述步骤S210具体是指:取RRhPI/pQE40 E.coli M15斜面菌种一环接种于PH值为6.8-7.6的培养基中，室温条件下以200-280rpm的速度进行振荡培养，通气量为1:1.3-1:1.6 ;所述培养基的主要成分为3-8g/L胰蛋白胨，l-3g/L谷氨酸，6-8g/L酵母浸膏，0.1-1.0g/L 硫酸钱，2-3g/L 葡萄糖，2-3g/L 甘油，90-110mg/L 氨节青霉素，40_60mg/L卡那霉素。进一步地，所述培养基的最优配比为5g/L胰蛋白胨，2g/L谷氨酸，7g/L酵母浸膏，0.5g/L硫酸钱，2.5g/L葡萄糖，2.7g/L甘油，100mg/L氨节青霉素，50mg/L卡那霉素；所述培养基用NaOH调节PH值至7.2。进一步地，所述步骤S300中缓冲液A的主要成分为40-60mmol/L Tris-HCl,0.2-0.8mmol/L EDTA，40-60mmol/L NaCl，5% 甘油，0.1-0.5mmol/L DTT ;所述缓冲液 A 的 PH值为 7.8-8.2 ο进一步地，所述步骤S300中缓冲液A的主要成分为50mmol/L Tris-HCl, 0.5mmol/L EDTA, 50mmol/L NaCl，5% 甘油，0.3mmol/L DTT ;所述缓冲液 A 的 PH 值为 7.9。进一步地，所述步骤S400中缓冲液B的主要成分为0.1%-0.3%β-硫基乙醇，5-50mmol/L Tris-HCl，5-lOmol/L 尿素；所述缓冲液 B 的 PH 值为 7.8-8.2。进一步地，所述步骤S400中缓冲液B的主要成分为0.2%β-硫基乙醇，30mmol/LTris-HCl，8mol/L尿素；所述缓冲液B的PH值为8.0。进一步地，所述步骤S400中缓冲液C的主要成分为40-70mmol/L Gly-NaOH,0.3%-0.5%的半胱氨酸；所述缓冲液C的PH值为9-10。进一步地，所述步骤S500中缓冲液D的主要成分为40-70mmol/L Gly-NaOH,10-50mmol/L GSSG，10-50mmol/L GSH ;所述缓冲液 D 的 PH 值为 9-10。进一步地，所述步骤S500中缓冲液D的主要成分为50mmol/L Gly-NaOH, 30mmol/L GSSG，30mmol/L GSH ;所述缓冲液 D 的 PH 值为 9.5。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点及有益效果:简化工艺流程，提高生产效率，改进广品品质，适应工业制备需求。【附图说明】图1为本专利技术的工艺流程不意图。【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术作进一步地详细说明，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1: 本实施例的，主要是通过下述技术方案实现:包括以下步骤: 步骤SlOO:制备菌种； 步骤S200:培养菌种； 步骤S300:包涵体的收集；将培养的菌种在-20°C以下冻干，然后用缓冲液A溶解，室温状态下振荡2-4h，固液分离后收集沉淀，得包涵体； 步骤S400:RRhPI初步纯化；将收集的包涵体用缓冲液B完全溶解后，再以缓冲液B与缓冲液C体积比为1:2-1:10添加缓冲液C，使蛋白浓度为0.05-0.5mg/ml，然后上于已用缓冲液B平衡的DEAE-S印harose FF柱，用NaCl梯度洗脱，收集含RRhPI的洗脱液； 步骤S500:RRhPI重组复性；初步纯化后的RRhPI通过Sephadex G-25脱尿素，再转换到缓冲液D中，4°C放置18h以上，得RRhPI复性液； 步骤S600:酶切转化；按胰蛋白酶、羧肽酶B、蛋白的质量比为2:1:2000，向RRhPI复性液中加入胰蛋白酶和羧肽酶B，室温酶切50-80min，然后用0.lmol/L ZnC12终止反应并沉淀生成hi ；步骤S700:hl的纯化；hl的纯化包括粗纯化和精纯化；所述粗纯化时，将步骤S600中的hi通过预置8_12mmol/L的Tris-HCl和0-1.0mmol/L的NaCl的两步柱层析，对hi进行初步提纯得到粗品；所述精纯化时，用10-20mmol/L本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组人胰岛素的工业制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S100：制备菌种；步骤S200：培养菌种；步骤S300：包涵体的收集；将培养的菌种在‑20℃以下冻干，然后用缓冲液A溶解，室温状态下振荡2‑4h，固液分离后收集沉淀，得包涵体；步骤S400：RRhPI初步纯化；将收集的包涵体用缓冲液B完全溶解后，再以缓冲液B与缓冲液C体积比为1:2‑1:10添加缓冲液C，使蛋白浓度为0.05‑0.5mg/ml，然后上于已用缓冲液B平衡的DEAE‑Sepharose FF柱，用NaCl梯度洗脱，收集含RRhPI的洗脱液；步骤S500：RRhPI重组复性；初步纯化后的RRhPI通过Sephadex G‑25脱尿素，再转换到缓冲液D中，4℃放置18h以上，得RRhPI复性液；步骤S600：酶切转化；按胰蛋白酶、羧肽酶B、蛋白的质量比为2:1:2000，向RRhPI复性液中加入胰蛋白酶和羧肽酶B，室温酶切50‑80min，然后用0.1mol/L ZnCl2 终止反应并沉淀生成hI；步骤S700：hI的纯化；hI的纯化包括粗纯化和精纯化；所述粗纯化时，将步骤S600中的hI通过预置8‑12mmol/L的Tris‑HCl和0‑1.0mmol/L的NaCl的两步柱层析，对hI进行初步提纯得到粗品；所述精纯化时，用10‑20mmol/L的色谱乙腈对粗品进行精制得到精品；步骤S800：hI成品；精品再经多次结晶和水洗后进入过滤除菌室，‑20℃以下冻干，得到hI成品；所述步骤S100具体是指：步骤S110：以人胰腺cDNA文库为模板，用PCR扩增技术提取目的基因；步骤S120：从用细胞工程培养的大肠杆菌中通过碱裂解法提取环装的pQE‑40质粒；步骤S130：分别取出目的基因和pQE‑40质粒，分别利用限制性内切酶Bam HI和Hind III同时酶切并产生粘性末端；步骤S140：在20℃以下，T4DNA连接酶的作用下，将目的基因与pQE‑40质粒结合通过粘性末端互补，形成一个能表达胰岛素的重组DNA；步骤S150：将含有目的基因的重组DNA放入大肠杆菌的培养液中并加入氯化钙，使大肠杆菌将重组DNA吸收，重组DNA转化E.coli感受态细胞M15；所述步骤S200具体是指：步骤S210：取出步骤S100中制备的菌种进行活化；步骤S220：采用二级发酵方式，恒温振荡2‑3h；步骤S230：用0.5mmol/L的IPTG诱导RRhPI/pQE40 E.coli M15菌种表达RRhPI。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张蛟，
申请(专利权)人：成都易胜科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51
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